310 10*1mm 스테인레스 스틸 코일 튜브 화학 성분, 스피드로인의 N 말단 도메인은 아밀로이드 원섬유를 기반으로 한 하이드로겔을 형성하고 단백질 고정을 위한 플랫폼을 제공합니다.

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사양

310 10*1mm 스테인레스 스틸 코일 튜브 공급 업체

화학적 구성 요소

기계적 성질

재조합 거미줄 단백질(거미줄 단백질)은 새로운 생체 ​​재료 개발에 많은 잠재적 응용 분야를 가지고 있지만, 다중 모드 및 응집이 발생하기 쉬운 특성으로 인해 얻기가 어렵고 사용하기 쉽습니다.여기에서 우리는 재조합 소형 스피드로인 단백질과 중요한 것은 N-말단 도메인(NT) 자체가 37°C에서 자립적이고 투명한 하이드로겔을 빠르게 형성한다는 것을 보고합니다.NT와 녹색 형광 단백질 또는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제로 구성된 융합 단백질은 완전한 기능의 융합 단백질을 형성합니다.하이드로겔.우리의 결과는 재조합 NT와 융합 단백질이 높은 발현 수율을 제공하고 하이드로겔에 투명성, 가교 없는 겔화 및 고밀도 활성 단백질의 직접 고정화와 같은 매력적인 특성을 부여한다는 것을 보여줍니다.
거미는 최대 7개의 서로 다른 실크 분비선 세트를 가지고 있으며 각각 특정 유형의 실크를 생산합니다.7개의 실크 종은 모두 약 6000개 잔기 길이의 거미 실크 단백질(스피드로인)로 구성되며 구형 N 및 C 말단 도메인(NT 및 CT)1,2으로 둘러싸인 큰 중앙 반복 영역을 포함합니다.가장 널리 연구된 실크 유형인 1차 팽대부는 1차 팽대부 샘에서 생성됩니다.이 샘에서는 상피 세포의 단층이 스파이드로인 단백질을 합성하여 분비선의 내강으로 분비하며, 그곳에서 이 단백질은 매우 높은 농도(30-50% w/v)3,4에서 용해성 형태(도핑)로 존재합니다.샘의 주요 팽대형 스피드로인 단백질의 구성과 형태에 대해서는 논쟁이 있었지만 대부분의 실험적 증거는 일반적으로 나선형 및/또는 무작위 나선형 형태와 미셀 또는 층상 구조가 있음을 나타냅니다5,6,7,8,9,10.반복 도메인은 실크 섬유의 기계적 특성을 조절하여 β 시트 나노결정과 비정질 구조를 형성하지만, 말단 도메인은 실크 분비선을 따라 변화하는 조건에 반응하여 실크 섬유를 조절합니다.실크 형성을 조절함으로써 19. 말단 도메인은 진화적으로 보존되며 그 기능은 모든 스피드로인 단백질에 공통적일 수 있습니다 2,20,21.분비선을 통과하는 동안 스피드로인의 pH는 약 7.6에서 < 5.716으로 감소하고 점차 좁아지는 관을 통한 이동에 의해 매개되는 전단 및 신장에 따라 증가합니다.용액에서 CT는 α-나선형 구성 평행 이량체이지만 낮은 pH 및 전단력에 반응하여 CT는 β층을 펼치고 전환하여 변환 16의 반복 영역에서 β층을 유발할 수 있습니다. NT는 다음과 같은 단위체입니다. 조건은 샘 내강의 조건을 반영하고 스피드로인의 용해도를 매개하지만, 감소된 pH에서 다수의 카르복실산 측쇄의 양성자화는 약 6.5의 pKa로 NT의 이량체화를 유도하여 NT를 안정화시키고 스피드로인을 크게 고정시킵니다. 수량.네트워크16,18.따라서 NT는 코팅의 단량체에서 섬유의 이량체로 변화하여 필라멘트 형성에 중요한 역할을 합니다.NT는 현재까지 연구된 모든 조건에서 높은 가용성과 나선형을 유지하며16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 이는 이종 단백질 생산을 위한 용해도 향상 라벨로 개발에 영감을 주었습니다.
1개의 NT, 1개의 짧은 반복 영역, 1개의 CT 및 정제용 His6 태그(His-NT2RepCT)로 구성된 재조합 미니 거미줄 단백질은 기본 거미줄 단백질만큼 수용성 완충액에 용해되며 실크 거미의 기본 특성을 모방합니다. .25.31.His-NT2RepCT는 pH 8 수용성 코팅이 pH 525,32,33,34,35 수조로 압출되는 생체 모방 기계를 사용하여 연속 섬유로 방사될 수 있습니다.His-NT2RepCT를 발현하는 E. coli의 생물반응기 발효 및 후속 후처리 결과 정제 후 >14 g/L 수율이 나타났습니다.높은 수율, 높은 용해도 및 산성 조건에 대한 His-NT2RepCT의 적절한 반응은 모두 NT23, 25, 34에 기인합니다.
여기에서 우리는 37°C에서 단백질 용액을 배양하여 NT 단독을 포함한 재조합 스피드로인 단백질로부터 투명한 하이드로겔의 급속한 형성을 보고합니다.티오플라빈 T 형광(ThT), 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR), 핵 자기 공명 분광법(NMR) 및 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 NT와 미세 거미 단백질이 β 시트 및 아밀로이드 유사 원섬유로 구조적 변형을 겪는다는 사실을 발견했습니다. 젤이 형성될 때.또한, NT와 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(PNP)의 융합 단백질은 완전한 기능의 융합 단편을 갖는 하이드로겔을 형성합니다.생리적 조건 하에서 하이드로겔의 신속한 형성과 결합된 이종 숙주에서의 높은 처리량 발현은 공학적 기능을 갖춘 하이드로겔의 비용 효율적인 생산 가능성을 열어줍니다.
대부분 보고된 재조합 스피드로인 단백질36과 달리 His-NT2RepCT는 pH 8의 Tris-HCl 완충액에서 안정적이며 침전 없이 최대 500mg/mL까지 농축될 수 있습니다25.따라서 우리는 이 단백질이 37°C에서 배양되었을 때 광학적으로 투명하고 자립형 하이드로겔을 빠르게 형성한다는 사실에 놀랐습니다(그림 1b-d).추가 연구에 따르면 His-NT2RepCT 겔화는 광범위한 단백질 농도(10-300 mg/mL)에서 발생했으며 이 농도는 겔화 시간과 반비례하는 것으로 나타났습니다(그림 1c 및 보충 그림 1).His-NT2RepCT의 어느 부분이 하이드로겔 형성을 중재하는지 알아보기 위해 플라스크 반전 분석을 사용하여 각 도메인을 개별적으로 그리고 다양한 조합으로 검사했습니다(그림 1a,b).침전된 2Rep를 제외하고 테스트된 모든 재조합 스피드로인 분획은 1시간 이내에 겔(300mg/mL의 단백질 농도)을 형성했습니다(그림 1b).이는 NT와 CT 단독이 조합되거나 반복과 연관되어 37°C에서 겔화될 수 있으며 His6 태그가 이 과정에 큰 영향을 미치지 않음을 시사합니다.NT가 가용성이 높고 안정적인 단백질이라는 일반적인 개념과 재조합 스피드로인 하이드로겔에 대한 이전 보고에서 젤화 효과가 반복 영역 및/또는 CT의 구조적 변화에 기인한다는 점을 고려하면 NT 자체가 그럴 수 있습니다.겔화의 발견은 예상치 못한 일이었습니다.보충 표 1) 37, 38, 39. 놀랍게도 NT는 ≥ 300 mg/mL의 농도에서 10분 이내에 이미 겔화되었습니다(그림 1c).다양한 농도의 NT를 사용한 바이알 반전 실험에서는 >50 mg/mL에서 NT 용액이 해당 농도(w/v, 그림 1c)에서 His-NT2RepCT보다 빠르게 겔화되는 것으로 나타났습니다.
본 연구에서 연구된 다양한 스피드로인 구조의 도식적 표현.b 37°C에서 바이알을 뒤집어 검증한 다양한 재조합 스피드로인 단백질(300mg/mL)의 겔화 시간.배양 없이 즉시 CT 겔(<300 mg/mL), 2Rep가 침전됩니다(300 mg/mL, 5 mm 규모).c 37°C에서 표시된 단백질 농도에서 His-NT2RepCT 및 NT의 겔화 시간.d 아래에 각각 거미와 문자 "NT"가 인쇄된 His-NT2RepCT 및 NT 하이드로겔의 사진(둘 다 200mg/mL, 눈금 막대 5mm).
다양한 재조합 스피드로인 단백질로 형성된 하이드로겔은 색상이 조금씩 다르며, 육안으로 관찰하면 투명도가 다양하게 나타납니다(그림 1b).NT 젤은 매우 투명하지만 다른 젤은 불투명해집니다.원통형 튜브에 캐스팅된 His-NT2RepCT 및 NT 겔은 그대로 금형에서 제거될 수 있습니다(그림 1d).
현재 재조합 스피드로인 단백질의 겔화를 유발하는 것으로 밝혀진 조건에서 천연 거미 실크 코팅이 겔화되는지 여부를 테스트하기 위해 스웨덴 다리 거미(Larinioides sclopetarius)의 큰 팽대부 샘에서 코팅을 수집했습니다.코팅은 50 mg / mL (측정 된 건조 중량 기준)의 20 mM Tris-HCl 완충액에 보관되었지만 37 ° C에서 21 일 배양 동안 겔화는 관찰되지 않았습니다 (보충 그림 2a).
이러한 겔을 정량화하기 위해 유변학적 측정을 사용하여 겔화 과정을 연구하고 전반적인 기계적 특성을 결정할 수 있습니다.특히, 높은 온도에서 저장 탄성률(탄성)을 모니터링하면 코팅의 점탄성 특성뿐만 아니라 겔화 온도에 대한 정보를 얻을 수 있습니다.온도 상승 실험(천연 실크 스톡 용액을 사용한 이전 연구에 기초하여 25-45°C에서 1°C/분 사용)40,41은 His-NT2RepCT 및 NT 용액의 저장 계수가 온도가 증가함에 따라 증가한다는 것을 보여주었습니다.증가했습니다 (그림 2 및 보충 그림 3).특히, NT 모듈은 His-NT2RepCT에 비해 더 낮은 온도에서 성장하기 시작했는데, 이는 NT가 37°C에서 His-NT2RepCT와 직접 배양되었을 때 관찰된 더 빠른 겔 시간과 일치합니다(그림 1).이후 온도가 떨어지면 저장 탄성률은 더 낮은 값으로 돌아가지 않고 손실 탄성률 이상으로 유지되어(보조 그림 3 참조) 열적으로 비가역적인 안정적인 겔화를 나타냅니다.겔화 후 100~500mg/mL 농도의 His-NT2RepCT 하이드로겔의 최종 탄성 계수는 ​​15~330kPa 범위였으며, NT 하이드로겔(100~500mg/mL)의 최종 탄성 계수는 ​​2~1400 범위였습니다. kPa (그림 2 및 전체 램프 데이터) 보충 그림 3 참조).
a His-NT2RepCT(300 mg/mL) 및 b NT(300 mg/mL) 측정 중 온도 변화.화살표는 온도 추세를 나타내며, 저장 모듈 데이터의 밝은 음영은 제조업체가 지정한 것보다 낮은 토크 값에서 기기에 대한 테스트를 나타냅니다. 이는 소음 증가의 원인입니다.c 고온(100, 300 및 500mg/mL) 후 His-NT2RepCT 및 NT의 말단 모듈 축적.모든 모듈 판독값은 0.1Hz의 주파수에서 수집됩니다.
겔화와 관련된 형태 변화를 조사하기 위한 잠재적인 방법으로 우리는 37°C에서 겔화 전후의 His-NT2RepCT 및 NT의 FTIR 스펙트럼을 기록했습니다(그림 3a,b).예상한 대로, His-NT2RepCT 및 NT 용액의 스펙트럼은 1645cm-1에서 뚜렷한 밴드를 갖는 α-나선/랜덤 코일 2차 구조를 나타내는 단백질에 해당합니다.두 하이드로겔의 경우, 겔화로 인해 약 1617cm-1 및 1695cm-1의 중간 I 밴드에 두 개의 팔이 형성되었으며(그림 3a, b), 이는 역평행 β-시트 구조가 형성되었음을 나타냅니다.이러한 변화는 각각의 2차 미분 및 차이 겔화 스펙트럼에서도 명확하게 볼 수 있습니다(보조 그림 4b).NT β층의 두 밴드는 His-NT2RepCT의 밴드보다 더 두드러졌으며, 이는 NT 하이드로겔의 β층 밴드의 총 함량이 NT2RepCT 하이드로겔의 것보다 높았음을 나타냅니다.
37°C에서 인큐베이션 전(용액)과 후(겔)의 His-NT2RepCT 및 b NT(둘 다 500mg/mL)의 FTIR 흡수 스펙트럼.c 재현탁된 50 mg/ml NT2RepCT 겔 및 d NT의 TEM 이미지.스케일 바 200nm.e His-NT2RepCT 및 NT 하이드로겔의 섬유 직경.n = 측정된 원섬유 100개, p < 0.0001.오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.오차 막대의 중앙이 평균입니다.통계 분석에는 짝이 없는 t-검정(양측)이 사용되었습니다.f 흔들림 없이 37°C에서 다양한 재조합 스피드로인 단백질(100mg/mL)의 ThT 형광.g 0%, 5%, 10% 및 20% 종자를 사용한 100mg/mL NT 겔의 NT(100mg/mL) 접종 실험.
투과전자현미경(TEM)을 사용하여 겔을 분석한 결과, 하이드로겔은 아밀로이드 유사 원섬유로 구성되어 있는 것으로 나타났습니다(그림 3c, 3d).NT로 형성된 원섬유는 길쭉하고(직경 5-12 nm) 분지되지 않은 반면, His-NT2RepCT 원섬유는 길이가 더 짧고 직경이 훨씬 더 넓습니다(7-16 nm)(그림 3e).이러한 결과를 통해 우리는 티오플라빈 T(ThT) 분석을 사용하여 섬유증의 동역학을 추적할 수 있었습니다.모든 재조합 스피드로인 단백질의 경우, 샘플을 37°C에서 배양할 때 형광 신호가 증가했습니다(그림 3f, 보충 그림 5a).이 발견과 일치하여, 겔화 조건에서 NT 및 His-NT2RepCT의 현미경 검사는 ThT 양성 응집체의 눈에 띄는 국소 축적 없이 ThT 형광의 균일한 증가를 나타냈습니다(보충 그림 5b,c).ThT 양성 원섬유의 형성은 NT 및 His-NTCT 탁도의 증가를 동반하지 않았습니다(보조 그림 5d). 이는 젤의 원섬유 네트워크가 젤 선명도를 손상시키지 않고 형성될 수 있음을 의미합니다.소량의 미리 형성된 원섬유를 첨가하여 파종하면 일부 아밀로이드의 원섬유 형성을 상당히 가속화할 수 있지만42,43,44 NT 하이드로응고제 용액에 5%, 10% 또는 20%(w/w) NT를 추가합니다.파종 효과 (그림 3g).아마도 이는 하이드로겔의 원섬유가 상대적으로 고정되어 있어 씨앗으로 사용할 수 없기 때문일 것입니다.
고온에서 재조합 스피드로인 단백질의 예상치 못한 거동으로 인해 겔 형성과 관련된 구조적 변화를 확인하기 위한 추가 핵자기공명(NMR) 분광학 연구가 촉발되었습니다.37°C에서 시간이 지남에 따라 기록된 His-NT2RepCT 용액의 NMR 스펙트럼은 CT가 여전히 부분적으로 접힌 반면 NT 및 2Rep 신호는 사라진 것을 보여 주었으며(그림 4a), 이는 부분적으로 His-NT의 형성을 제어한 것이 주로 NT 및 2Rep임을 시사합니다. NT2RepCT 하이드로겔.CT 신호도 원래 강도의 20%로 감쇠되었는데, 이는 CT도 대부분 고정되어 하이드로겔 구조에 통합되어 있음을 시사합니다.사전 배양된 샘플에서처럼 이동성이 있어 용액 NMR로 관찰되는 CT의 작은 부분의 경우 스펙트럼에는 처음 10개의 구조화된 잔기에 대한 신호가 부족합니다. 이는 아마도 His-NT2Rep의 부착된 부분이 고정되기 어렵기 때문일 수 있습니다.하이드로겔 상태 -NT2RepCT의 NMR 스펙트럼은 α-나선 및 β-층의 우세한 존재를 나타냈으며, 그 정도는 덜하지만 무작위 코일 형태를 나타냈습니다(그림 4b).NT에만 존재하는 메티오닌 잔기의 화학적 이동 분석은 이 도메인이 β-시트 구조로 변환되었음을 보여주었습니다.용액 내 NT의 시간 의존적 스펙트럼은 신호 강도의 균일한 감소를 보였으며(그림 4c), NT 하이드로겔의 고체 NMR은 대부분의 NT 잔기가 β-시트 구조로 변환되었음을 보여주었습니다(그림 4d).2Rep의 형태는 응집되는 경향으로 인해 별도로 결정할 수 없습니다.그러나 NTCT와 His-NT2RepCT 하이드로겔의 고체 NMR 스펙트럼은 매우 유사해 보였으며(그림 4b, 보충 그림 6b), 이는 2Rep가 His-NT2RepCT 하이드로겔의 구조적 부분에 거의 기여하지 않았음을 나타냅니다.CT 하이드로겔의 경우 α-나선, β-시트 및 무작위 나선형 2차 구조가 존재하는 것으로 나타났습니다(보충 그림 6d).이는 CT의 일부 부분이 α-나선으로 남아 있고 다른 부분은 β-시트가 됨을 의미합니다.따라서 NMR 분광학의 결과는 NT가 하이드로겔 형성에 중요하며 2Rep 및 CT와의 융합 시 β-시트 형태로 변형된다는 것을 시사합니다.이와 일치하여 우리는 최근 NT 도메인의 5개 나선 모두에서 아밀로이드 공간 지퍼가 형성될 가능성이 있음을 발견했으며 Waltz 알고리즘은 나선 1에서 아밀로이드 생성 영역을 예측했습니다(그림 4e).
37°C에서 배양 전(파란색)과 배양 후 19시간(빨간색)의 15N-HSQC 10mg/mL His-NT2RepCT 용액의 2D 스펙트럼.빨간색 스펙트럼의 개별 교차 피크와 파란색 스펙트럼의 F24, G136, 폴리A는 단일 문자 아미노산 기호와 잔기 번호로 표시됩니다.삽입된 부분은 NT, 2Rep 및 CT 도메인에서 선택된 잔기에 대한 시간에 따른 신호 강도의 의존성을 보여줍니다.b His-NT2RepCT 하이드로겔의 고체 무선 주파수(RFDR) 스펙트럼.RFDR 스펙트럼에서 관찰된 Cα/Cβ 잔기의 상관관계는 모델 펩타이드 화학적 이동 및 통계82,83 및 해당 2차 구조에서 파생된 값과 비교하여 결정되었습니다.SSB – 회전 측파대.c 37°C에서 36시간 동안 배양하는 동안 15N-HSQC 10mg/mL NT 용액의 1차원 스펙트럼.삽입된 내용은 시간에 따른 체적 강도를 보여줍니다.d NT 하이드로겔의 고체 상태 RFDR 스펙트럼.RFDR 스펙트럼에서 관찰된 Cα/Cβ 잔기와 그 2차 구조의 상관관계가 표시됩니다.e 지퍼 데이터베이스(https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/)의 NT45.79 세동 성향 프로필을 기반으로 합니다.헥사펩타이드의 공간 번개 이동 창의 로제타 에너지는 kcal/mol로 표시됩니다.빨간색 막대는 섬유증 성향이 높은 헥사펩타이드를 나타냅니다(Rosetta 에너지는 -23kcal/mol 미만, 점선 아래).녹색 막대는 로제타 에너지가 임계값보다 높은 조각을 나타내므로 입체 지퍼를 형성할 가능성이 적습니다.프롤린을 포함하는 단편은 분석에서 제외되었습니다(열 없음).사각형은 Waltz 알고리즘81(https://waltz.switchlab.org)에 의해 예측된 아밀로이드증 영역을 나타냅니다.NT의 아미노산 잔기 서열이 맨 위에 있고, β 2차 구조에서 발견되는 잔기 유형(고체 NMR 분광법으로 결정됨)이 빨간색으로 표시됩니다.5개의 NT α나선의 위치는 (H1-H5)28로 지정됩니다.
pH <6.5에서 HT는 이합체화되어 열이나 요소에 의한 변성에 저항성을 갖습니다18.NT 이량체화 및 안정성이 겔화에 어떤 영향을 미치는지 설명하기 위해 100mg/ml NT가 포함된 용액을 바이알 반전 테스트를 사용하여 pH 8, 7 및 6에서 제어했습니다.pH 8 및 7에서 배양된 NT 샘플은 37°C에서 30분 후에 겔화되었지만 pH 8 겔은 투명하게 유지된 반면 pH 7 겔은 눈에 보이는 침전물을 나타냈습니다(그림 5a).대조적으로, pH 6에서 HT를 함유한 용액은 겔을 형성하지 않았으며, 37°C에서 20분 후에 큰 침전물을 볼 수 있었습니다.이는 이량체 자체 및/또는 단량체에 비해 높은 안정성이 겔화를 방지한다는 것을 의미합니다.pH 7 및 6에서 NT에 대한 침전물 형성은 예상되지 않았는데, 그 이유는 NT가 200 mg/ml에서 용해되고, 열 변성 후에 쉽게 다시 접히고, 더 낮은 값에서 α-나선을 유지하는 것으로 보고되었기 때문입니다. pH 18. 이러한 불일치에 대한 가능한 설명은 이전에 보고된 실험이 실온 이하 또는 상대적으로 낮은 단백질 농도에서 수행되었다는 것입니다16,18,19.
37°C에서 배양 후 pH 8, 7, 6 및 154mM NaCl(pH 8)에서 NT 바이알 반전 테스트(100mg/mL).b 각각 154mM NaF 및 154mM NaCl이 있거나 없는 NT CD 스펙트럼.222 nm에서의 몰 타원율은 자연 주름의 비율로 변환됩니다.c NT 반전 분석(100mg/mL) NT*(37°C 및 60°C), NTA72R(37°C) 및 His-NT-L6(37°C 및 60°C).d NT 돌연변이체 NT*, NTA72R 및 His-NT-L6의 CD 스펙트럼.222 nm에서의 몰 타원율은 자연 주름의 비율로 변환됩니다.e NTFlSp, NTMiSp 및 환원된 NTMiSp(100mg/mL)의 역전 테스트.스케일 바 5mm.f NT, NTFlSp, NTMiSp 및 환원된 NTMiSp의 CD 스펙트럼.222 nm에서의 몰 타원율은 자연 주름의 비율로 변환됩니다.25°C 및 95°C의 전체 NT 스펙트럼은 보충 그림 8에 나와 있습니다.
생리학적 염 농도는 NT 서브유닛 간의 정전기적 상호작용과 더 낮은 pH18로의 NT 이동의 이량체화를 결정합니다.우리는 154 mM NaCl과 NaF의 존재가 실제로 각각 겔화를 억제하고 (그림 5a, b, 보충 그림 2b) 이러한 염이 NT 단량체의 열 안정성을 증가시키는 것을 발견했습니다 (그림 5b, 보충 그림 8) .이는 또한 이량체화보다는 안정성 향상이 겔 형성을 방지한다는 것을 시사합니다.
단백질 이량체화 및 겔화 안정성의 역할을 추가로 조사하기 위해 우리는 낮은 pH28.30에서도 단량체로 남아 있는 두 가지 돌연변이체 NT* 및 NTA72R을 사용했습니다.NT*는 단량체의 겉보기 쌍극성 전하 분포가 평탄화되는 이중 전하 역전 돌연변이로, 이량체화를 방지하고 단량체 안정성을 대폭 증가시킵니다.NTA72R은 전하를 띤 쌍극자이지만 Arg 치환 Ala가 이합체 경계에 위치하므로 돌연변이가 이합체화에 필요한 하위 단위 상호 작용을 방해합니다.37°C에서 배양 시 NT*는 하이드로겔을 형성하지 않은 반면, NTA72R은 15분 동안 불투명한 겔을 형성했습니다(그림 5c).NT*와 NTA72R은 모두 이량체화할 수 없지만 단량체 안정성이 다르기 때문에(그림 5d), 이러한 결과는 높은 열역학적 안정성이 NT가 겔화되는 것을 방지한다는 것을 강력히 시사합니다.이는 HT*가 고온에서 불안정할 때(60°C에서 8분 후, 그림 5c) 겔을 형성한다는 사실에서도 뒷받침됩니다.이전에는 NT의 높은 함량의 메티오닌이 자연적인 접힘을 액화하고 6개의 Met에서 Leu로의 대체물(여기서는 His-NT-L6이라고 함)이 NT46 단량체를 강력하게 안정화시키는 것으로 나타났습니다.NT 겔 형성에 구조적 유연성이 필요하다는 가정에 기초하여 우리는 His-NT-L6 안정 돌연변이가 37 °C에서 겔화되지 않음을 발견했습니다 (그림 5c, d).그러나 His-NT-L6도 60°C에서 60분간 배양하면 겔을 형성했습니다(그림 5c).
β-시트 구조로 변형되어 하이드로겔을 형성하는 NT의 능력은 스피드로인의 NT 도메인 전체가 아닌 일부에 적용되는 것으로 보입니다.다양한 실크 유형과 거미 종인 Trichonephila clavipes (NTFlSp)의 NT는 상대적으로 낮은 메티오닌 함량과 높은 열 안정성에도 불구하고 겔을 형성했습니다 (그림 5e, f 및 보충 표 2).대조적으로, 열 안정성이 낮고 메티오닌 함량이 높은 Araneus Ventricosus(NTMiSp)의 작은 팽대형 단백질 스피드로인의 NT는 하이드로겔을 형성하지 않았습니다(보충 표 2 및 그림 5e, f).후자는 분자내 이황화 결합의 존재와 연관될 수 있습니다.일관되게 NTMiSp의 이황화 결합이 감소하면 37°C에서 10분간 배양한 후 하이드로겔을 형성했습니다(그림 5e).결론적으로 구조적 유연성은 NT로부터 겔을 형성하는 기준이지만 유일한 기준은 아니라는 점에 유의해야 합니다.관련될 수 있는 또 다른 요인은 아밀로이드 원섬유를 형성하는 경향이며, 지퍼 데이터베이스와 Waltz 알고리즘을 사용한 분석은 젤 형성 능력과 아밀로이드 생성 영역의 존재 및 예측 영역의 범위 사이의 상관관계를 보여주었습니다. 입체 지퍼를 형성합니다.상관 관계가있었습니다 (보충 표 2 및 보충 그림 9).
유리한 조건에서 원섬유를 형성하고 겔을 형성하는 NT의 능력으로 인해 우리는 다른 단백질 단편과의 NT 융합이 여전히 융합 파트너의 모든 기능을 갖춘 겔을 형성할 수 있다는 가설을 세웠습니다.이를 테스트하기 위해 우리는 NT의 C 말단에 녹색 형광 단백질(GFP)과 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(PNP)를 각각 도입했습니다.생성된 융합 단백질은 매우 높은 최종 수율(His-NT-GFP 및 His-NT-PNP에 대해 각각 150 mg/L 및 256 mg/L 진탕 플라스크 배양)로 E. coli에서 발현되었으며, 이는 표시된 것과 일치합니다. NT에 융합된 기타 단백질의 경우 Ref.30. His-NT-GFP(300mg/mL) 및 His-NT-PNP(100mg/mL) 융합 단백질은 37°C에서 2시간 및 6.5시간 후에 겔을 형성했으며, 중요한 것은 GFP 분획이 변하지 않은 상태로 유지되었다는 것입니다.겔화 후에 초기 형광 강도의 >70%가 남아 있는 것으로 나타났습니다(그림 6a).his-NT-PNP 용액 및 겔에서 PNP 활성을 측정하기 위해 순수한 제제의 효소 활성이 겔화 농도에서 분석의 검출 범위를 벗어났기 때문에 융합 단백질을 NT로 희석해야 했습니다.0.01 mg/mL His-NT-PNP와 100 mg/mL NT를 함유한 혼합물로 형성된 겔은 사전 배양된 샘플의 초기 효소 활성의 65%를 유지했습니다(그림 6b).측정 중에 겔은 그대로 유지되었습니다 (보조 그림 10).
가시광선 및 UV 광선 하에서 His-NT-GFP(300 mg/mL) 및 His-NT-GFP 하이드로겔(300 mg/mL)을 함유한 거꾸로 된 바이알의 겔화 전후의 상대 형광 강도.점은 개별 측정값(n = 3)을 나타내고 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다.평균값은 오류 막대 중앙에 표시됩니다.b PNP 활성은 NT(100mg/ml)와 0.01mg/ml his-NT-PNP 및 100mg/ml New Taiwan Dollar를 포함하는 혼합물로 구성된 용액과 젤을 사용하여 형광 분석을 통해 얻었습니다.삽입된 그림은 His-NT-PNP(5mm 눈금 막대)가 포함된 하이드로겔이 들어 있는 거꾸로 된 바이알을 보여줍니다.
여기에서 우리는 37°C에서 단백질 용액을 배양하여 NT 및 기타 재조합 스피드로인 단백질로부터 하이드로겔이 형성되는 것을 보고합니다(그림 1).우리는 겔화가 α-나선의 β-층으로의 변형 및 아밀로이드 유사 원섬유의 형성과 연관되어 있음을 보여줍니다(그림 3 및 4).NT는 며칠 동안 4°C에서 200mg/mL 이상의 농도에서 매우 높은 용해도와 높은 안정성으로 알려진 코일형 구형 5개 나선 다발이기 때문에 이 발견은 놀랍습니다27.또한 NT는 낮은 단백질 농도(μM)에서 열 변성 후 쉽게 다시 접힙니다.우리의 결과에 따르면, 원섬유 형성에는 >10 mg/mL 단백질 농도와 약간 높은 온도의 조합이 필요합니다(그림 1).이는 생리학적 조건에서 열 변동으로 인해 부분적으로 펼쳐진 상태에 있는 구형으로 접힌 단백질로부터 아밀로이드 원섬유가 형성될 수 있다는 생각과 일치합니다48.이러한 전환을 겪는 단백질의 예로는 인슐린49,50, β2-마이크로글로불린, 트랜스티레틴 및 리소자임51,52,53이 있습니다.NT는 원래 상태에서는 α-나선형이지만 폴리펩티드 사슬의 약 65%가 입체 지퍼 형성과 호환됩니다(그림 4e) 45.단량체는 동적으로 이동하기 때문에46 적당히 상승된 온도에서 이러한 잠재적인 아밀로이드 생성 영역을 노출시킬 수 있으며 고농도의 총 단백질에서는 아밀로이드 원섬유 형성을 위한 임계 농도에 도달할 수 있습니다54.이러한 추론에 따라 우리는 스피드로인 농도와 겔화 시간 사이에 음의 상관관계가 있음을 발견했으며(그림 1c), 단량체성 NT 형태가 돌연변이(NT*, His-NT-L6) 또는 염 첨가에 의해 안정화되면 하이드로겔을 형성합니다(그림 5).
대부분의 경우 아밀로이드 원섬유는 용액에서 침전물로 사라지지만 특정 조건에서는 하이드로겔을 형성할 수 있습니다.하이드로겔 형성 피브릴은 일반적으로 높은 종횡비를 가지며 분자 얽힘을 통해 안정적인 3차원 네트워크를 형성하는데,55,58 이는 우리의 결과와 일치합니다.시험관 내 하이드로겔 형성의 경우, 단백질은 유기 용매, 고온(70~90°C) 및/또는 낮은 pH(1.5~3.0)에 노출되는 등으로 인해 완전히 또는 부분적으로 펼쳐지는 경우가 많습니다.여기에 설명된 스피드로인 하이드로겔은 가혹한 처리가 필요하지 않으며 하이드로겔을 안정화하기 위해 가교제가 필요하지도 않습니다.
실크 방사 중에 β-시트 전환을 겪는 것으로 보이는 스피드로인 반복과 QD가 하이드로겔을 형성한다는 것이 이전에 보고되었습니다.우리의 연구 결과에 비해 배양 시간 및/또는 배양 온도는 각각 상당히 길거나 높았으며 생성된 하이드로겔은 종종 불투명했습니다(그림 7 및 보충 표 1). , 69. 빠른 겔 시간 외에도 300mg/mL 이상의 NT 하이드로겔(30%)은 설명된 다른 모든 재조합 거미 실크 단백질 하이드로겔은 물론 젤라틴, 알기네이트(2%), 한천(0.5%)과 같은 천연 하이드로겔보다 성능이 뛰어났습니다. ) 및 콜라겐.(0.6%) (그림 7 및 보충 표 1 및 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
본 연구에서 하이드로겔의 겔화 시간과 탄성률은 다른 스피드로인 기반 하이드로겔 및 선택된 천연 하이드로겔과 비교되었습니다.겔화 조건에 대한 설명과 함께 참고 자료가 제공됩니다.APS 과황산암모늄, 실온.데이터 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
거미는 저장 중에 스피드로인이 겔화되는 것을 방지하는 방법을 개발한 것으로 보입니다.견사샘의 단백질 농도가 높음에도 불구하고, 말단 도메인과 관련된 큰 반복 영역은 이 연구의 경계에서 샘의 NT 및 CT의 겉보기 농도가 약 10-20mg/ml에 해당함을 의미합니다.시험관 내에서 관찰된 하이드로겔 형성에 필요합니다.또한, 유사한 농도의 염 16은 실크 분비샘에서와 같이 NT를 안정화시켰다(그림 5b).NT 형태는 E. coli 세포질에서 연구되었으며 시험관 내에서 검사했을 때보다 더 단단히 접혀 있는 것으로 밝혀졌으며 이는 소금이나 기타 요인이 생체 내에서 NT의 응집을 방지한다는 것을 더욱 나타냅니다.그러나 β-시트 원섬유로 변환되는 NT의 능력은 필라멘트 형성에 중요할 수 있으며 향후 연구에서 조사되어야 합니다.
본 연구에서 관찰된 NT-아밀로이드 유사 원섬유 및 하이드로겔 형성의 새로운 측면 외에도 우리는 이 현상이 생명공학 및 생물의학적 응용이 있을 수 있음을 보여줍니다(그림 8).개념 증명으로 우리는 NT를 GFP 또는 PNP와 결합하여 융합 단백질이 37°C에서 배양할 때 하이드로겔을 형성하고 GFP 및 PNP 분획이 겔화 후에도 활성을 크게 유지한다는 것을 보여주었습니다(그림 6).뉴클레오사이드 포스포릴라제는 뉴클레오사이드 유사체75의 중요한 촉매 합성이며, 이는 우리의 발견이 바이오제약 산업과 관련이 있게 만듭니다.유리한 조건에서 투명한 하이드로겔을 형성하는 융합 단백질을 발현한다는 개념은 효소 고정화, 제어된 약물 방출 및 조직 공학과 같은 광범위한 응용 분야에 유리한 특성을 가진 기능화된 하이드로겔을 생성할 수 있게 해줍니다.또한 NT와 NT*는 효율적인 발현 마커입니다30. 이는 NT와 그 변이체가 가용성 융합 단백질의 고효율 생산과 이후 3D 하이드로겔에서 고정된 표적 단백질의 생성에 사용될 수 있음을 의미합니다.
NT는 가용성이고 α-나선형이며 낮은 농도(μM) 및 37°C에서 안정적입니다.동일한 온도에서 농도가 증가하면(>10 mg/ml) NT는 아밀로이드 유사 원섬유로 구성된 겔을 형성합니다.NT 융합 단백질은 또한 완전한 기능의 융합 단편을 갖는 원섬유형 겔을 형성하여 NT를 사용하여 다양한 단백질을 3D 하이드로겔에 고정시킬 수 있습니다.하단: NT(PDB: 4FBS) 및 섬유 네트워크 및 관련 단백질 구조의 그림(가정 및 비율에 맞게 그려지지 않음, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
구조물(아미노산 서열을 포함한 전체 목록은 보충 표 4 참조)을 플라스미드 pT7에 클로닝하고 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시켰습니다.조작된 플라스미드를 함유한 대장균을 카나마이신(70 mg/l)이 보충된 루리아 브로쓰에 접종하고 30°C 및 250 rpm에서 밤새 성장시켰습니다.이어서, 배양물을 카나마이신을 함유하는 LB 배지에 1/100 접종하고 OD600이 0.8에 도달할 때까지 30℃ 및 110rpm에서 배양하였다.NMR 연구를 위해 동위원소를 사용한 단백질 표지를 위해 D-글루코스 13C(Aldrich) 2g과 염화암모늄 15N(Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) 1g을 포함하는 M9 최소 배지에서 박테리아를 성장시켰습니다.온도를 섭씨 20도로 낮추고 0.15 mM 이소프로필티오갈락토피라노시드(최종 농도)로 단백질 발현을 유도합니다.밤새 단백질 발현 후, 세포를 7278 xg, 4℃에서 20분 동안 수확하였다.세포 펠렛을 20mM Tris-HCl, pH 8에 재현탁하고 추가 사용 시까지 동결시켰습니다.해동된 세포를 30 kPa에서 세포 파괴기(TS 시리즈 기계, Constant Systems Limited, England)를 사용하여 용해시켰습니다.그런 다음 용해물을 4°C에서 30분 동안 25,000g에서 원심분리했습니다.NTMiSp의 경우, 펠렛을 2M 우레아, 20mM Tris-HCl, pH 8에 재현탁시키고 2분간 초음파 처리한 다음(2초 on/off, 65%) 25,000xg, 4℃에서 다시 원심분리했습니다. 30 분.상등액을 Ni-NTA 컬럼에 로딩하고 20mM Tris-HCl, 2mM imidazole, pH 8로 세척한 후 마지막으로 20mM Tris-HCl, 200mM imidazole, pH 8로 단백질을 용출시켰다. NT2RepCT를 생성하고 NTCT, 트롬빈 ​​소화는 His와 NT 사이에 부위(ThrCleav)를 도입합니다.트롬빈 절단 부위는 His-NT-ThrCleav-2Rep(2Rep 생성), His-thioredoxin-ThrCleav-NT(NT 생성), His-thioredoxin-ThrCleav-CT(CT 생성), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT에도 존재합니다. .*(NT* 생성), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R(NTA72R 생성), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp(NTF1Sp 생성) 및 His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp(NTMiSp 생성).구조물을 트롬빈(1:1000)으로 분해하고 분자량 역치가 6-8 kDa인 Spectra/Por 투석 막을 사용하여 20 mM Tris-HCl, pH 8을 사용하여 4℃에서 밤새 투석했습니다.투석 후, 용액을 Ni-NTA 컬럼에 로딩하고 관심 단백질을 함유한 유출물을 수집합니다.단백질 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 Bradford 분석법을 사용한 NTF1Sp를 제외하고 각 단백질의 흡광계수를 이용하여 280 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 결정하였다.순도는 SDS 폴리아크릴아미드(4~20%) 겔 전기영동 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색으로 결정되었습니다.단백질은 원심분리기 필터(VivaSpin 20, GE Healthcare)를 사용하여 20분 주기로 10kDa 분자량 컷오프를 갖는 4000xg로 농축되었습니다.
단백질 용액을 해동하고 150μl를 1ml 투명 격막 바이알(8 x 40mm Thermo Scientific)에 조심스럽게 피펫팅합니다.증발을 방지하기 위해 튜브의 뚜껑을 덮고 파라필름으로 밀봉했습니다.샘플(n = 3)을 37°C 또는 60°C에서 배양하고 주기적으로 뒤집어 겔화를 관찰했습니다.겔화되지 않은 샘플은 적어도 1주일 동안 배양되었습니다.10μM 단백질당 10mM DTT로 NTMiSp 이황화 결합을 줄입니다.천연 거미 실크 코팅의 겔화를 분석하기 위해 스웨덴 다리 거미를 절단하고 두 개의 주요 확장된 샘을 200 μl의 20 mM Tris-HCl 완충액 pH 8에 넣고 절단하여 코팅이 분비선에서 분리되도록 했습니다..분비선의 내용물을 완충액에 용해시킵니다. 건조 중량 측정을 위해 50μl(60°C에서 항량까지 열린 바이알을 배양하여), 37°C에서 겔화를 위해 150μl를 사용합니다.
측정 형상/도구는 상단 직경이 20mm이고 간격이 0.5mm인 평행판을 사용하여 스테인레스 스틸로 만들어졌습니다.스테인리스 스틸 바닥 펠티에 플레이트를 사용하여 샘플을 분당 1°C의 속도로 25°C에서 45°C로 가열한 다음 다시 25°C로 가열합니다.진동 측정은 각각 100mg/mL 및 300-500mg/mL의 샘플에 대해 5% 및 0.5%의 변형률에서 0.1Hz의 주파수와 재료의 선형 점탄성 영역에서 수행되었습니다.증발을 방지하려면 맞춤형 습도 챔버를 사용하십시오.데이터는 Prism 9을 사용하여 분석되었습니다.
실온 800~3900cm–1의 적외선(IR) 스펙트럼을 수집하는 데 사용됩니다.ATR 장치와 분광계를 통과하는 빛의 경로는 실험 전과 실험 중에 건조된 여과 공기로 퍼지됩니다.용액(스펙트럼에서 수분 흡수 피크를 최소화하기 위한 500mg/mL)을 결정 위에 피펫으로 주입하고 측정 전에 젤(500mg/mL)을 형성한 다음 결정으로 옮겼습니다(n = 3).1000회의 스캔이 2cm-1의 해상도와 0의 듀티 사이클 2로 기록되었습니다. 2차 도함수는 OPUS(Bruker)를 사용하여 9점의 평활화 범위를 사용하여 계산되었습니다.스펙트럼은 F. Menges "Spectragryph – 광학 분광학 소프트웨어"를 사용하여 1720과 1580cm-1 사이의 동일한 통합 영역으로 정규화되었습니다.ATR-IR 분광학에서 적외선 빔이 시료에 침투하는 깊이는 파수에 따라 달라지며, 결과적으로 높은 파수보다 낮은 파수에서 흡수가 더 강해집니다.이러한 효과는 그림 1 및 2에 표시된 스펙트럼에 대해 수정되지 않았습니다.3은 매우 작기 때문입니다(보조 그림 4).이 수치의 수정된 스펙트럼은 Bruker OPUS 소프트웨어를 사용하여 계산되었습니다.
원칙적으로 아미드 I 피크 내 구성 요소의 안정적인 디콘볼루션 후에 단백질 형태의 포괄적인 정량화가 가능합니다.그러나 실제로는 몇 가지 장애물이 발생합니다.스펙트럼의 노이즈는 디컨볼루션 중에 (거짓) 피크로 나타날 수 있습니다.또한 물 굴곡으로 인한 피크는 아미드 I 피크의 위치와 일치하며 여기에서 연구된 수성 겔과 같이 다량의 물을 포함하는 샘플에 대해 비슷한 크기를 가질 수 있습니다.따라서 우리는 아미드 I 피크를 완전히 분해하려고 시도하지 않았으며 우리의 관찰은 NMR 분광법과 같은 다른 방법을 뒷받침하는 경우에만 고려해야 합니다.
50 mg/ml NT 및 His-NT2RepCT 용액을 37°C에서 밤새 겔화했습니다.그런 다음 하이드로겔을 20mM Tris-HCl(pH 8)로 12.5mg/ml의 농도로 희석하고 잘 흔들고 피펫으로 이동하여 겔을 파괴했습니다.다음으로 하이드로겔을 20mM Tris-HCl(pH 8)로 10배 희석한 후, formvar로 코팅된 구리 그리드에 시료 5μl를 도포하고, 블로팅 페이퍼로 여분의 시료를 제거하였다.샘플을 5μl의 MilliQ 물로 두 번 세척하고 1% 우라닐 포르메이트로 5분간 염색했습니다.흡수지로 과도한 얼룩을 제거한 후 메쉬를 자연 건조시킵니다.100kV에서 작동하는 FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN을 사용하여 이러한 그리드에서 이미징을 수행했습니다.이미지는 Veleta 2k × 2k CCD 카메라(Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany)를 사용하여 x 26,500 및 x 43,000 배율로 기록되었습니다.각 샘플(n = 1)에 대해 10-15개의 이미지가 기록되었습니다.ImageJ(https://imagej.nih.gov/)는 이미지 분석 및 섬유 직경 측정(n = 100, 다양한 섬유)에 사용되었습니다.Prism 9는 짝이 없는 t-검정(양측)을 수행하는 데 사용되었습니다.평균 His-NT2RepCT 및 NT 원섬유는 각각 11.43(SD 2.035) 및 7.67(SD 1.389) nm였습니다.신뢰 구간(95%)은 -4.246~-3.275입니다.자유도 = 198, p < 0.0001.
10μM 티오플라빈 T(ThT)를 함유한 80μl의 액체 샘플을 Corning 96-well 검정색 바닥 투명 바닥 플레이트(Corning Glass 3881, USA)를 사용하여 정적 조건에서 3회(n = 3) 측정했습니다.440nm 여기 필터 및 480nm 방출 필터(독일 오펜부르크 소재 BMG Labtech의 FLUOStar Galaxy)를 사용하여 형광 차이를 기록했습니다.신호 강도를 변경하지 않고 다양한 농도의 ThT를 사용한 실험이 수행되었으므로 ThT 신호는 포화되거나 소멸되지 않았습니다.헤이즈 측정을 위해 360 nm에서 흡광도를 기록합니다.접종 실험을 위해, 100 mg/mL 겔을 37℃에서 형성하고, 재현탁시키고, 5%, 10% 및 20%의 몰비로 접종에 사용했습니다.데이터는 Prism 9을 사용하여 분석되었습니다.
His-NT2RepCT 및 NT >100 mg/mL의 스톡을 얼음 위에서 해동하고 0.22 μm 필터를 통해 필터링합니다.Nanodrop을 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 계산했습니다.바닥이 투명한 96웰 검정색 비결합 플레이트(Corning)의 웰에서 샘플을 20mM Tris-HCl pH 8에서 20mg/ml로 희석하고 5μM ThT(최종 농도)와 혼합했습니다. 총 샘플 농도 50 μl 볼륨.ThT 이미징을 위한 투과광 채널과 FITC 여기 및 방출 필터 세트가 있는 CellObserver(Zeiss) 현미경을 사용하여 37°C에서 10분마다 샘플을 이미지화했습니다.이미징에는 20x/0.4 렌즈가 사용됩니다.이미지 분석에는 Zen Blue(Zeiss) 및 ImageJ(https://imagej.nih.gov/)가 사용되었습니다.또한 20mM Tris pH 8 및 5μM ThT를 함유한 50mg/mL 농도의 NT 및 His-NT2RepCT 용액으로부터 겔을 제조하고 37°C에서 90분 동안 배양했습니다.겔 조각을 비결합 검정색 96 웰 투명 바닥 플레이트에 있는 20mM Tris, pH 8 및 5μM ThT를 함유하는 새로운 웰로 옮겼습니다.20x/0.4 배율로 녹색 형광 및 명시야 이미지를 획득합니다.ImageJ는 이미지 분석에 사용되었습니다.
용액 NMR 스펙트럼은 QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe(HFCN)가 장착된 600MHz Bruker Avance Neo 분광계에서 310K에서 얻었습니다.13C, 15N으로 표지된 10mg/mL 균질 단백질을 함유하고 20mM Tris-HCl(pH 8), 0.02%(w/v) NaN3, 5% DO(v/v)에 용해된 NMR 샘플(n = 1) .pH 6.7에서 NT2RepCT의 화학적 이동을 사용하여 15N-HSQC의 2D 스펙트럼에서 피크 23을 지정했습니다.
13C, 15N 표지 하이드로겔의 매직 앵글 스피닝 고체 NMR(MAS) 스펙트럼은 3.2mm 13C/15N{1H} 무전자 프로브가 장착된 800MHz의 Bruker Avance III HD 분광계에서 기록되었습니다.샘플 온도는 277K의 가변 온도 가스 흐름을 사용하여 제어되었습니다. DARR(2차원 쌍극자 회전 공명)76 및 RFDR(무선 주파수 재연결) 스펙트럼은 각각 12.5kHz 및 20kHz의 MAS 주파수에서 획득되었습니다.1H에서 13C까지의 교차 편파(CP)는 1H에서 60.0에서 48.0kHz, 13C에서 61.3/71.6kHz(12.5/20kHz MAS) 및 접촉 시간 0.5-1ms의 선형 램프를 사용하여 수행되었습니다.데이터 수집 중에 73.5kHz의 Spinal6478 디커플링이 사용되었습니다.획득 시간은 10밀리초이고 주기 지연은 2.5초였습니다.RFDR 스펙트럼에서 관찰된 단일 연결 Cα/Cβ 상관 관계는 DARR 스펙트럼의 특징적인 잔류물 유형 화학적 이동 및 다중 연결 상관 관계를 기반으로 할당되었습니다.
지퍼79 데이터베이스(https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/)는 NT, NTFlSp 및 NTMiSp에 대한 플러터 경향과 Rosetta 에너지를 평가하는 데 사용되었습니다.지퍼 데이터베이스는 여러 자유 에너지 기능을 결합하여 단백질 구조를 모델링하고 분석하는 Rosetta Energy80을 계산합니다.-23 kcal/mol 이하의 에너지 수준은 세동 경향이 높다는 것을 나타냅니다.에너지가 낮다는 것은 지퍼 구조에서 두 개의 β-가닥의 안정성이 더 높다는 것을 의미합니다.또한 Waltz 알고리즘을 사용하여 NT, NTFlSp 및 NTMiSp Ref에서 아밀로이드 생성 영역을 예측했습니다.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT 단백질 용액을 pH 5.5 및 6.0의 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) 완충액과 혼합하여 pH를 각각 pH 6 및 7로 낮추었습니다.최종 단백질 농도는 100mg/ml였습니다.
측정은 0.1cm의 광학 경로를 갖는 300μL 큐벳을 사용하여 J-1500 CD 분광계(JASCO, USA)에서 수행되었습니다.단백질을 20mM 인산염 완충액(pH 8)에서 10μM(n=1)로 희석했습니다.염의 존재 하에서의 단백질 안정성을 분석하기 위해, 각각 154mM NaF 또는 NaCl을 함유하는 20mM 인산염 완충액(pH 8)에서 동일한 농도(n=1)로 단백질을 분석하였다.온도 스캔은 1°C/min의 가열 속도로 25°C에서 95°C까지 222 nm에서 기록되었습니다.자연적으로 접힌 단백질의 비율은 공식 (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal)을 사용하여 계산되었습니다.또한 25°C에서 95°C로 가열한 후 260 nm에서 190 nm까지 각 샘플에 대해 5개의 스펙트럼이 기록되었습니다.5개의 스펙트럼을 평균화하고 평활화한 후 몰 타원율로 변환했습니다.데이터는 Prism 9을 사용하여 분석되었습니다.
His-NT-GFP(300mg/mL, 80μL)의 형광 강도는 정적 조건에서 검정색 투명 바닥이 있는 96웰 Corning 플레이트(Corning Glass 3881, USA)에서 3회(n=3) 측정되었습니다.여기 파장이 395 nm인 형광 기반 플레이트 판독기로 샘플을 측정하고 겔화 전 509 nm에서 방출을 기록하고 37°C에서 2시간 후에 방출을 기록합니다.데이터는 Prism 9로 분석되었습니다.
퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 활성 분석 키트(형광법, Sigma Aldrich)를 제조업체의 지침에 따라 사용했습니다.His-NT-PNP가 포함된 젤 및 용액의 활성을 측정하려면 10ng의 His-NT-PNP와 100mg/mL NT를 총 부피 2μL로 혼합하세요. 젤이 세트의 검출 간격보다 높은 신호를 제공했기 때문입니다.His-NT-PNP가 없는 젤 및 용액에 대한 대조군이 포함되었습니다.측정은 두 번 수행되었습니다(n = 2).활성을 측정한 후, 반응 혼합물을 제거하고 측정 동안 겔이 손상되지 않았는지 확인하기 위해 겔을 사진 촬영했습니다.데이터는 Prism 9을 사용하여 분석되었습니다.
연구 설계에 대한 자세한 내용은 이 기사에 링크된 Nature 연구 초록을 참조하세요.
그림 1과 2는 초기 데이터를 나타냅니다.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f 및 6, 보충 그림.3, 보충 그림.5a, d, 보충 그림.6 및 보충 그림.8. 데이터 이 연구의 데이터는 Zenodo 데이터베이스 https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653에 호스팅되어 있습니다.이 연구에서 얻은 NMR 데이터는 항목 ID bmrbig36으로 BMRBig 저장소에 게시되었습니다.GFP와 PNP의 구조는 PDB(GFP 2B3Q, PNP 4RJ2)에서 가져왔습니다.
Rising, A. 및 Johansson, J. Spinning 인공 거미줄.내셔널 케미칼.생물학.11, 309-315(2015).
Babb, PL 외.Nephila clavipes 게놈은 거미줄 유전자의 다양성과 그 복잡한 발현을 강조합니다.내셔널 제네트.49, 895–903(2017).