ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 화학 산업 화학 성분용 이중 용접 튜브, SPECC1L의 결핍은 접합 조인트의 안정성을 높이고 두개골 신경 능선 세포의 흘림을 감소시킵니다.

Nature.com을 방문해 주셔서 감사합니다.CSS 지원이 제한된 브라우저 버전을 사용하고 있습니다.최상의 경험을 위해서는 업데이트된 브라우저를 사용하거나 Internet Explorer에서 호환 모드를 비활성화하는 것이 좋습니다.또한 지속적인 지원을 보장하기 위해 스타일과 JavaScript가 없는 사이트를 표시합니다.

ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 화학 산업을 위한 이중 용접 튜브

요청시허SS재료유한회사스테인레스 스틸 이음매없는 파이프, 밝은 단련 튜브, 이음매없는 코일 튜브 등을 전문으로하는 선도적 인 제조업체입니다.고객의 편의를 위해 파이프와 튜브도 용접했습니다.요청시허SS재료유한회사가장 진보된 생산 및 테스트 장비를 보유하고 있습니다.우리는 귀하의 요구 사항을 완전히 만족시킬 수 있습니다.매우 엄격한 표준에 따르면 당사에서 생산하는 튜브는 항상 정확한 OD 및 WT 허용 오차를 갖습니다.공차 관리는 표준을 생산하기 위한 엄격한 준수입니다.우리 의 제품 은 항상 고객 에게 만족 하고 있습니다 .우리 제품을 구매한 고객은 더 많은 수익을 창출했습니다.
a) OD (외경) : 3.18mm ~ 101.6mm
b) WT (벽 두께) : 0.5mm ~ 20mm
c) 길이 : 고객의 요구 사항에 따라
d) 표준: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 등
e) 처리 방법 : ERW, EFW 등

슬라이드당 기사 3개를 표시하는 슬라이더입니다.슬라이드 사이를 이동하려면 뒤로 및 다음 버튼을 사용하고, 각 슬라이드 사이를 이동하려면 끝에 있는 슬라이드 컨트롤러 버튼을 사용하세요.
두개골 신경 능선 세포(CNCC)는 배아 신경 주름에서 떨어져 나와 대부분의 안면 중앙 구조를 형성하는 인두궁으로 이동합니다.CNCC 기능 장애는 일반적인 선천성 기형인 구강안면파열의 원인에 중요한 역할을 합니다.이형접합성 SPECC1L 돌연변이는 비정형 및 증후군성 갈라진 틈이 있는 환자에서 발견되었습니다.여기에서 우리는 배양된 SPECC1L 녹다운 세포에서 표준 접착 접합(AJ) 구성 요소, β-카테닌 및 E-cadherin의 향상된 염색을 보고하고 전자 현미경 사진은 AJ의 정점 기저 확산을 보여줍니다.두개안면 형태 형성에서 SPECC1L의 역할을 이해하기 위해 Specc1l 결핍 마우스 모델을 만들었습니다.동형접합성 돌연변이는 배아에 치명적이며 손상된 신경관 폐쇄 및 CNCC 적층을 나타냅니다.AJ 단백질 염색은 돌연변이 신경 주름에서 증가합니다.이 AJ 결함은 AJ 용해가 필요한 CNCC 박리 결함과 일치합니다.또한 Specc11 돌연변이체는 PI3K-AKT 신호 전달을 감소시키고 세포사멸을 증가시켰습니다.시험관 내에서, 야생형 세포에서 PI3K-AKT 신호전달의 온화한 억제는 AJ 변화를 유도하기에 충분했습니다.중요한 것은 SPECC1L 녹다운에 의해 유도된 AJ 변화가 PI3K-AKT 경로의 활성화에 의해 역전될 수 있다는 것입니다.종합적으로 말하자면, 이러한 데이터는 PI3K-AKT 신호 전달 및 AJ 생물학의 새로운 조절자로서 SPECC1L이 신경관 폐쇄 및 CNCC 계층화에 필요함을 시사합니다.
두개골 신경 능선 세포(CNCC)는 등쪽 신경외배엽에 위치하며 상피-중간엽 전환(EMT)1,2,3과 관련된 과정을 통해 발달 중인 신경 주름의 신경 표피에서 분리됩니다.사전 이동하는 상피 CNCC는 세포간 접합을 파괴하고 첫 번째 및 두 번째 인두 궁을 채우고 두개안면 연골의 대부분을 형성하는 이동하는 중간엽 CNCC가 됩니다.따라서 CNCC 기능을 조절하는 유전자는 구순구개열과 같은 두개안면 선천 기형의 병인에서 종종 중단되며, 가장 일반적으로 미국에서만 1/800 출생에 영향을 미칩니다.선천적 기형 중 하나8.
CNCC의 박리는 생쥐의 배아 발생 8.5~9.5일 사이에 전방 신경관이 폐쇄되는 것과 일치합니다.다수의 마우스 구강 안면 갈라짐 관련 유전자의 돌연변이는 Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 및 Pdgfrα12를 포함하여 일부 형태의 신경관 결함을 나타냅니다.그러나 Splotch 돌연변이 마우스(Pax3)가 CNCC 층화 또는 이동에 아무런 영향을 주지 않고 신경관 폐쇄에 결함을 나타내기 때문에 신경관 폐쇄 및 CNCC 계층화 과정은 독립적인 것으로 간주될 수 있습니다13,14.CNCC 해부 및 신경관 폐쇄에 결함이 있는 추가 마우스 모델은 이 두 과정의 공통 분자 기반을 설명하는 데 도움이 될 것입니다.
신경상피 세포에서 CNCC를 분리하려면 E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin 및 액틴 필라멘트와 관련된 α-actinin을 포함하는 단백질 복합체로 구성된 접착 접합(AJ)의 용해가 필요합니다 2 과발현 연구 신경 주름의 E-cadherin은 CNCC 박리의 감소 또는 지연을 보여주었습니다.반대로, E-cadherin의 억제는 조기 계층화를 초래합니다15,16.CNCC 계층화 동안 EMT를 중재하는 많은 요인은 전사 인자(AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10)와 기질 금속단백분해효소(MMP)와 같은 세포외 기질(ECM) 리모델링 단백질이지만, CNCC는 직접적인 세포골격 AJ 조절자입니다. 아직 알려지지 않았습니다.PI3K-AKT 경로는 주로 암 연구에서 E-cadherin 수준을 길항하는 것으로 알려져 있습니다.최근 연구에 따르면 생쥐에서 PDGFα 기반 PI3K-AKT 신호 전달이 상실되면 구개열 및 신경관 결함을 비롯한 두개안면 이상이 발생하는 것으로 나타났습니다.그러나 PI3K-AKT 경로와 CNCC 계층화 시 AJ 안정성 사이의 관계는 불분명합니다.
우리는 이전에 입에서 눈까지 이어지는 경사 구개열(ObFC) 또는 Tessier IV18 구개열로 알려진 심각한 구순열이 있는 두 사람의 첫 번째 돌연변이 유전자로 SPECC1L을 확인했습니다.SPECC1L 돌연변이는 상염색체 우성 Opitz G/BBB 증후군(OMIM #145410)이 있는 두 다세대 가족에서 확인되었으며, 이 가족의 경우 영향을 받은 개인이 초거리 및 구순구개열을 나타냈고19 경골 과거리 증후군이 있는 한 가족(OMIM #145420)20 .Opitz G/BBB 증후군 사례의 절반 이상이 X-연관(OMIM #300000)이며 미세소관 관련 세포 골격의 단백질 22를 암호화하는 MID1 유전자의 돌연변이로 인해 발생합니다.우리는 미세소관 및 액틴 세포골격과 관련된 단백질인 SPECC1L이 세포 접착 및 이동 동안 액틴 세포골격 리모델링에 필요한 신호 전달을 중재할 수 있다는 가설을 세웁니다 18.시험관 내 및 생체 내 연구를 통해 우리는 SPECC1L을 PI3K-AKT 신호 전달을 통한 AJ 안정성의 새로운 조절자로 설명합니다.세포 수준에서 SPECC1L 결핍은 범-AKT 단백질의 수준을 감소시키고 AJ의 정점-기저 분산을 증가시켰으며 이는 AKT 경로의 화학적 활성화에 의해 제거되었습니다.생체 내에서 Specc11이 결핍된 배아는 신경관 폐쇄 장애와 CNCC 해부 감소를 보여줍니다.따라서 SPECC1L은 얼굴 형태 형성 중 정상적인 CNCC 기능에 필요한 고도로 조절된 세포 접착 기반 신호 전달에서 기능합니다.
세포 수준에서 SPECC1L의 역할을 특성화하기 위해 우리는 SPECC1L18이 결핍된 이전에 설명한 안정한 골육종 세포주 U2OS를 사용했습니다.SPECC1L(kd) 녹다운이 있는 이러한 안정적인 U2OS 세포는 액틴 세포골격의 이동 및 재구성에 결함이 있음과 함께 SPECC1L 전사체 및 단백질 수준이 중간 정도(60-70%) 감소했습니다. SPECC1L은 유사분열 결함을 유발하는 것으로 나타났습니다23.추가 특성화를 통해 우리는 안정적인 SPECC1L-kd 세포가 매우 높은 수준의 합류에서 형태를 변경한다는 것을 발견했습니다(그림 1).낮은 합류점의 개별 대조 세포와 kd 세포는 유사해 보였습니다(그림1A,D).융합 24시간 후, 대조 세포는 입방체 모양을 유지한 반면(그림 1B, E), SPECC1L-kd 세포는 신장되었습니다(그림 1C, F).세포 모양의 이러한 변화 정도는 대조 세포와 kd 세포의 생체 내 실시간 영상화를 통해 포착되었습니다(동영상 1).합류 세포에서 SPECC1L의 역할을 확인하기 위해 먼저 그 발현을 조사했습니다.우리는 SPECC1L 단백질 수준이 융합 시 증가하는 것을 발견했습니다(그림 1G). 반면 SPECC1L 전사 수준은 증가하지 않았습니다(그림 1H).또한, 세포 밀도가 증가함에 따라 SPECC1L 단백질은 세포간 경계에 축적되었으며(그림 2A-E), 패턴은 막 관련 β-카테닌의 패턴과 중첩되었습니다(그림 2A'-E').SPECC1L과 액틴 세포골격의 연관성을 고려하여 우리는 SPECC1L이 액틴 기반 접착 접합(AJ)과 상호작용한다는 가설을 세웠습니다.
(AF) SPECC1L 녹다운(DF) 세포는 대조군 U2OS 세포(AC)에 비해 높은 합류(F)에서 연장됩니다.여기에는 서로 다른 세포 밀도에 대해 선택한 6개의 시점(T1, T3, T6) 중 3개가 표시되어 있습니다.(G) SPECC1L 단백질이 대조 세포의 낮은 합류도에 비해 높은 합류도에서 안정화된다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯 분석.SPECC1L의 웨스턴 블롯은 예상되는 120kDa 밴드와 더 높은 분자량 밴드(아마도 번역 후 변형됨(*))를 보여줍니다.낮은 합류와 높은 합류에 대해 동일한 조건에서 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다.낮은 합류점과 높은 합류점에서 SPECC1L을 보여주는 이미지는 동일한 블롯에서 가져왔습니다.동일한 얼룩을 제거하고 β-액틴 항체로 재검사했습니다.(H) 정량적 RT-PCR 분석은 SPECC1L 전사체 수준에 유의미한 변화가 없음을 보여주었습니다.오차 막대는 4개의 독립적인 실험에서 얻은 SEM을 나타냅니다.
(AE) 우리는 SPECC1L 녹다운(kd)을 사용하여 U2OS 세포의 세포 모양 분석 및 AJ 변화를 표준화하기 위해 다양한 세포 밀도를 나타내는 6개의 시점(T1-T6)을 선택했습니다.이들 시점 중 처음 5개에는 단일 세포(T1), 작은 세포 클러스터의 50-70% 융합(T2), kd 세포 재형성 없는 융합(T3), kd 세포 재형성(T4) 및 24시간 변화가 포함되었습니다.kd(T5) 세포의 후방 형태.SPECC1L 단백질은 T1(A)에서 세포질에 주로 분산되었지만 후속 시점(B-E, 화살표)에서 세포간 경계에서 그 축적이 관찰되었습니다.(FJ) β-카테닌은 AJ 복합체와 연관된 세포간 경계에서 유사한 축적을 나타냅니다.(A'-E') SPECC1L 및 β-카테닌은 높은 세포 밀도에서 세포 경계에서 중복 염색을 나타냅니다(화살표).(F'-J') SPECC1L-kd 세포에서 β-카테닌 염색은 낮은 세포 밀도(F'-H')에서는 정상으로 보이지만 세포 모양이 변경됨에 따라 확장됩니다(I', J'; 화살표). 변경되었습니다.바 = 10μm.
그런 다음 SPECC1L 결핍이 AJ에 미치는 영향을 확인하려고 했습니다.우리는 표준 구성 요소인 F-actin, myosin IIb, β-catenin 및 E-cadherin을 포함한 여러 AJ 관련 마커를 사용했습니다.액틴 스트레스 섬유는 이전에 설명한 대로 SPECC1L-kd 세포에서 증가했습니다(그림 3A, B)18.액틴 필라멘트와 연관된 미오신 IIb는 시험관 내에서 SPECC1L-kd 세포에서 유사한 증가를 보여주었습니다(그림 3C,D).AJ 관련 β-카테닌은 세포막의 카드헤린과 결합하여 대조 큐비사이트에서 정상적인 "벌집 모양" 발현 패턴을 보여줍니다(그림 3E,G).흥미롭게도 공초점 현미경을 사용한 평면 이미지에서 융합 SPECC1L 결핍 세포의 세포막에 염색된 β-catenin(그림 3E, F) 및 E-cadherin(그림 3G, H)은 확장된 염색의 두드러진 패턴을 보여주었습니다.kd 세포에서 AJ 관련 β-카테닌 염색의 이러한 확장은 합류점에서 가장 두드러졌지만 세포 모양의 변화보다 먼저 나타나는 것으로 나타났습니다(그림 2F-J, F'-J').이 확장된 AJ 염색의 물리적 특성을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)을 통해 SPECC1L-kd U2OS 세포의 정점 기저 표면의 세포 경계를 검사했습니다(그림3I,J).AJ(화살표)를 나타내는 별도의 전자 밀도 영역이 있는 대조 세포(그림 3I)와 달리, kd 세포(그림 3J)는 정점기저면을 따라 AJ를 나타내는 높은 전자 밀도의 크고 연속적인 영역을 보여주었습니다..또한 횡단면에서 우리는 kd 세포에서 광범위한 세포막 접힘을 관찰했습니다 (그림 S1A, B). 이는 β-catenin 및 E-cadherin 염색 밴드의 확장 된 패턴을 설명합니다 (그림 3F, H).AJ에서 SPECC1L의 역할을 뒷받침하기 위해, β-카테닌은 융합성 U2OS 세포의 용해물에서 SPECC1L과 공동 면역침전되었습니다(그림 3K).AJ 마커에 대한 확장된 면역 염색과 함께 TEM 분석은 SPECC1L 결핍이 AJ 정점 기저 밀도 및 분산을 증가시킨다는 우리의 가설과 일치했습니다.
(AH) 융합 후 48시간에 kd 세포에서 F-액틴 염색이 증가했습니다(T6; A, B).F-액틴과 관련된 미오신 IIb의 염색 변경(C, D).대조 세포(E, G)에서 β-카테닌 및 E-카데린 막 염색의 부드러운 패턴은 SPECC1L-kd(F, H) 세포에서 향상되었습니다.바 = 10μm.(I-J) 정점-기저 세포 간 접합을 관찰하는 전자 현미경 사진.대조 세포는 끈적한 접합(I, 화살표)을 나타내는 뚜렷한 전자 밀도 영역을 보여줍니다.대조적으로, SPECC1L-kd 세포의 전체 정점-기저 접합은 전자 밀도(J, 화살표)로 나타났으며, 이는 접착 접합의 밀도 및 분산이 증가했음을 나타냅니다.(K) β-카테닌은 융합성 U2OS 세포 용해물에서 SPECC1L과 공동 면역침전되었다.4개의 독립적인 실험 중 하나를 나타내는 한 지점에서 찍은 이미지입니다.
두개 안면 형태 형성에서 SPECC1L의 역할을 이해하기 위해 우리는 두 개의 독립적인 ES 트랩 세포주 DTM096 및 RRH048(BayGenomics, CA)을 사용하여 Specc1l 결핍 마우스 모델을 만들었습니다. 이는 인트론 1을 나타내고 Specc1l 전사물은 15에서 캡처되었습니다(그림 1). .도 4A, 그림 S2).미끼 벡터 삽입물의 게놈 위치는 전체 게놈 서열 분석에 의해 결정되고 PCR에 의해 확인되었습니다 (그림 S2).두 유전자 트랩 디자인 모두 캡처 시 Specc11-lacZ 리포터의 프레임 내 융합을 허용했습니다.따라서 X-gal 염색을 통해 결정된 lacZ 발현을 Specc11 발현의 지표로 사용했습니다.두 대립유전자 모두 유사한 lacZ 발현 패턴을 보였으며, 인트론 1의 DTM096 유전자 트랩은 인트론 15의 RRH048보다 더 강한 발현을 나타냈습니다(표시되지 않음).그러나 Specc1l은 E8.5(그림4B)의 신경 주름, E9.5 및 E10.5(그림4C,D)의 신경관 및 안면 과정 및 사지 발달에서 특히 강한 발현으로 널리 발현됩니다. E10에서.5 및 눈(그림4D).우리는 이전에 E10.5의 첫 번째 인두 궁에서 SPECC1L 발현이 CNCC 계통과 일치하는 상피와 기본 중간엽에 존재한다고 보고했습니다.CNCC에서 SPECC1L 발현을 테스트하기 위해 E8.5 신경 접기(그림 4E-J) 및 E9.5 두개골 섹션(그림 4K-)을 수행했습니다.E8.5에서 SPECC1L은 NCC 마커로 염색된 세포(그림 4G, J)를 포함하여 신경 주름을 강하게 염색했습니다(그림 4E, H).E9.5에서 SPECC1L(그림 4K, N)은 AP2A(그림 4L, M) 또는 SOX10(그림 4O, P)과 함께 염색된 이동 CNCC로 강하게 염색되었습니다.
(A) ES DTM096(인트론 1) 및 RRH048(인트론 15) 세포 클론에 미끼 벡터 삽입을 보여주는 마우스 Specc11 유전자의 도식적 표현.(BD) E8.5에서 E10.5까지 Specc1l 발현을 나타내는 이형 ​​접합 Specc1lDTM096 배아의 lacZ 염색.NE = 신경외배엽, NF = 신경 주름, PA1 = 첫 번째 인두궁.(EP) E8.5(NF; EJ) 신경 주름 및 E9.5(KP) 두개골 절편에서 NCC 마커 AP2A 및 SOX10을 사용한 SPECC1L 면역염색.SPECC1L 염색은 AP2A(F, G; 화살촉) 및 SOX10(I, J; 화살촉)으로 표지된 세포를 포함하여 신경 주름 E8.5(E, H; 화살촉)에서 널리 관찰되었습니다.E9.5에서 SPECC1L은 AP2A(L, M; 화살표) 및 SOX10(O, P; 화살표)으로 표시된 이동 CNCC(K, N; 화살표)를 강하게 염색했습니다.
이형접합성 Specc1lDTM096/+와 Specc1lRRH048/+ 마우스 사이의 교배는 두 유전자 트랩 대립유전자가 상보적이지 않으며 두 유전자 트랩 대립유전자에 대한 복합 이형접합체와 배아 동형접합체가 배아에 치명적이라는 것을 보여줍니다(표 S1).멘델의 비율은 출생 시 이형접합체의 생존율이 감소함을 나타냅니다(예상 1.34 대 2.0).우리는 이형접합체 중 주산기 사망률이 낮았으며 일부는 두개안면 기형을 나타냈습니다(그림 S3).그러나 이러한 주산기 두개안면 표현형의 침투율이 낮기 때문에 근본적인 병리생리학적 메커니즘을 연구하기가 어렵습니다.따라서 우리는 동형 접합 Specc11 돌연변이의 배아 치명적인 표현형에 중점을 두었습니다.
대부분의 복합 이형접합성 또는 동형접합 Specc1lDTM096/RRH048 돌연변이 배아는 E9.5-10.5 이후에 발생하지 않았으며(그림 5A-D), 신경관은 앞쪽으로 닫히지 않았으며(그림 5B, D) 때로는 뒤쪽으로 닫혔습니다(표시되지 않음) ..이 두개골 신경관 폐쇄 결함은 E10.5의 신경 주름에 남아 있는 DLX2로 표시된 대부분의 CNCC와 연관되어 해부가 없음을 나타냅니다(그림 5A'-D').CNCC의 전체 크기도 감소했는지 확인하기 위해 Wnt1-Cre 및 ROSAmTmG를 사용하여 유전자 트랩 라인에서 CNCC 라인에 GFP 태그를 지정했습니다.우리는 전체 배아에서 정렬된 GFP+ NCC 및 GFP-(RFP+) 비 NCC를 스트리밍합니다.E9.5에서 흐름 분류된 GFP 표지 CNCC의 비율은 WT와 돌연변이 배아(표시되지 않음) 간에 크게 변하지 않았으며 이는 정상적인 CNCC 사양을 나타냅니다.따라서 우리는 노출된 신경 주름의 잔류 Wnt1-Cre 및 DLX2 염색(그림 5B')이 CNCC 레이어링 결함으로 인한 것이며, 아마도 SPECC1L-kd 세포에서 볼 수 있듯이 AJ 세포의 밀도 또는 분산 증가로 인한 것일 수 있다는 가설을 세웠습니다.우리는 NCC 마커 SOX10, AP2A 및 DLX2를 사용하여 신경 주름에서 CNCC의 존재를 확인했습니다(그림 5E-R).E8.5에서는 WT(그림 5E, G, I) 및 Specc1l 돌연변이(그림 5F, H, J) 섹션에서 세 가지 NCC 마커 모두에 대한 신경 접힘 염색이 관찰되었습니다.E9.5에서 NCC 마커는 WT 섹션에서 이동하는 NCC로 염색되었지만(그림 5M, O, Q), Specc1l 돌연변이 배아의 노출된 신경 주름에서 잔류 NCC 염색이 관찰되었습니다(그림 5N, P, R).SOX10 및 DLX2는 CNCC 이동을 표시하기 때문에 이 결과는 SPECC1L이 결핍된 CNCC가 이동 후 사양을 달성하지만 신경 주름에서 이동하지 못함을 나타냅니다.
Specc11 결핍은 신경관 폐쇄 결함, 두개골 신경 능선 세포 및 AJ의 박리로 이어집니다.
(A, B') E9.5 WT(A) Wnt1-Cre(A')로 표지된 이동하는 두개골 신경 능선 세포(CNCC)를 운반하는 배아.대조적으로, Specc11 돌연변이 배아는 개방형 신경 주름(B), 화살촉) 및 이동되지 않은 CNCC(B', 화살촉)를 보여줍니다.(C, D') E10.5 WT 배아(C, C') 및 Specc1l(D, D')의 CNCC 마커 DLX2의 명시야 이미지(C, D') 및 면역염색(C', D').WT E10.5 배아에서 DLX2 양성 CNCC는 아가미 궁(C', 화살표)을 식민지화하는 반면, 돌연변이에서는 열린 신경 주름(D', 화살표)과 첫 번째 인두 궁(D', 화살표).) 일부 염색(화살표)은 CNCC의 박리 및 이동이 불량함을 나타냅니다.ER) E8.5(E-L) 및 E9.5(M-R) 단계의 WT 및 Specc1l 돌연변이 배아 섹션은 NCC 마커 SOX10(E, F, M, N), AP2A(G, H, O, P) 및 DLX2(I, J, Q, R).E8.5에서는 야생형 신경접힘(NF) 및 돌연변이 절편에서 NCC 염색이 관찰되었습니다.E8.5 WT(K) 및 돌연변이체(L)에서 SOX10과 β-카테닌의 공동 염색은 신경 주름의 세포 경계에서 β-카테닌 염색이 증가한 것으로 나타났습니다.E9.5에서는 이동하는 CNCC(M, O, Q)의 야생형 염색이 관찰된 반면, 돌연변이에서는 층화되지 않은 CNCC가 열린 신경 접힘(N, P, R)을 염색했습니다.(S–Z) E9.5 돌연변이가 있는 WT 및 Specc11DTM096/RRH048 배아의 관상 섹션에서 생체 내 AJ 라벨링 분석.대략적인 단면이 오른쪽 상단에 표시되어 있습니다.돌연변이 조직 절편에서는 F-액틴(S, T)과 미오신 IIb(U, V)의 염색 증가가 관찰되었습니다.그림 3의 시험 관내 결과와 유사하게 돌연변이 배아에서 β-catenin (W, X) 및 E-cadherin (Y, Z)에 대한 향상된 막 염색이 관찰되었습니다.(AA-BB) 정점 기저 세포의 경계 너머를 바라보는 야생형 배아 단면의 전자 현미경 사진은 접착 접합을 나타내는 뚜렷한 전자 밀도 영역을 보여줍니다(AA, 화살표).대조적으로, Specc11 돌연변이 배아(BB, 화살표) 섹션에서는 전체 정점기저 접합부가 전자 밀도가 높으며 이는 접착 접합부의 밀도와 분산이 증가했음을 나타냅니다.
감소된 층화가 AJ 변경으로 인한 것이라는 가설을 테스트하기 위해 Specc1l 돌연변이 배아의 노출된 신경 주름에서 AJ 라벨링을 조사했습니다(그림 5S-Z).우리는 액틴 스트레스 섬유의 증가 (그림 5S, T)와 액틴 섬유에서 미오신 IIB 염색의 국소화 증가를 관찰했습니다 (그림 5U, V).중요하게도 우리는 세포 간 경계에서 β-catenin (그림 5W, X)과 E-cadherin (그림 5Y, Z)의 염색 증가를 관찰했습니다.우리는 또한 E8.5 배아의 신경 주름에서 NCC의 β-catenin 염색을 조사했습니다 (그림 5K, L).β-카테닌 염색은 Specc1l 돌연변이 신경 주름에서 더 강한 것으로 나타났으며(그림 5L 및 K), 이는 AJ 변화가 시작되었음을 나타냅니다.E9.5 배아 두개골 단면의 전자 현미경 사진에서 우리는 WT와 비교하여 Specc1l 돌연변이 배아에서 확산 전자 밀도 염색이 증가한 것을 다시 관찰했습니다 (그림 5AA, BB 및 S1E-H).종합하면, 이러한 결과는 SPECC1L-kd U2OS 세포의 시험관 내 결과를 뒷받침하며 비정상적인 AJ 염색이 돌연변이 배아에서 CNCC 층화보다 먼저 발생함을 시사합니다.
AKT 활성과 E-cadherin 안정성 사이의 알려진 길항 관계를 고려하여 우리는 PI3K-AKT 신호 전달이 관련되어 있다는 가설을 세웠습니다.또한 우리는 E9.5-10.5에서 치사율 (<5 %)을 피하고 대신 E13.5 주변에 정착 한 일부 돌연변이 배아에서 표피 아래 물집이 관찰되었습니다 (그림 S3).표피하 소포는 PDGFRα12에 기반한 감소된 PI3K-AKT 신호 전달의 특징입니다.Fantauzzoet al.(2014)은 PdgfraPI3K/PI3K 돌연변이 배아에서 PDGFRα 기반 PI3K 활성화가 중단되면 표피하 소포, 신경관 결함 및 구개열 표현형이 발생한다고 보고했습니다.실제로, Pan-AKT 및 활성 인산화된 Ser473-AKT의 수준은 Specc1l 돌연변이 조직의 생체 내에서 E9.5 배아 정지로 감소되었습니다(그림 6A-D).인산화된 Ser473-AKT 수준의 감소는 전적으로 생체 내(도 6E) 및 시험관 내(도 6F) pan-AKT 수준의 감소로 인한 것일 수 있습니다.시험관 내 감소는 U2OS 세포가 세포 모양 및 AJ 밀도의 변화와 강하게 합류한 경우에만 관찰되었습니다(그림6D).따라서 우리의 데이터는 SPECC1L이 두개 안면 형태 형성에서 PI3K-AKT 신호 전달의 새로운 양성 조절 인자임을 시사합니다.
(A-E) 활성 인산화된 S473-AKT 및 pan-AKT 단백질 감소 수준을 보여주는 Specc1l 돌연변이 배아(E)의 E8.5(A,B) 및 E9.5(C,D) 두개골 섹션 또는 E9.5 용해물 , 대조군 WT와 비교하여.동일한 조건에서 야생형 용해물과 돌연변이 용해물에 대해 웨스턴 블롯팅을 수행했습니다.SPECC1L에 표시된 이미지는 하나의 블롯에서 가져온 것입니다.동일한 얼룩을 제거하고 항-pan-ACT 및 β-액틴 항체를 사용하여 재검사했습니다.E8.5 신경 주름(A, B)의 Pan-AKT 수준과 E9.5 두개골 절편의 인산화된 S473-AKT 수준이 크게 감소했습니다.(F) Pan-AKT 수준은 높은 합류점에서 수확된 SPECC1L-kd U2OS 세포의 용해물에서 유사하게 감소되었습니다.오류 막대는 세 가지 독립적인 웨스턴 블롯 정량화의 SEM을 나타냅니다.(GJ) 각각 KI67 및 절단된 카스파제 3으로 염색된 E9.5의 WT 배아 섹션은 세포 증식(G, G') 및 작은 세포사멸 활성(H, H')을 나타냅니다.Specc11 돌연변이 배아는 비슷한 세포 증식을 나타내지만(I), 세포사멸을 겪는 세포의 수가 크게 증가합니다(J).
그런 다음 증식과 세포사멸의 마커를 조사했습니다.우리는 KI67 염색으로 측정한 WT 돌연변이의 경우 82.5%, Specc1l 돌연변이의 경우 86.5%의 증식 지수를 갖는 E9.5 배아(I와 비교한 그림 6E, G)의 증식에서 어떤 차이도 관찰하지 못했습니다(p <0.56, Fisher's 정확한 테스트).유사하게, 우리는 배아 정지(표시되지 않음)(표시되지 않음)까지 E8.5의 신경 주름에서 절단된 카스파제 3에 대한 염색으로 측정된 세포사멸의 어떠한 차이도 관찰하지 못했습니다.대조적으로, 모든 E9.5 돌연변이 배아에서 세포사멸이 유의하게 증가하였다(도 6F, H 및 J).세포사멸의 이러한 전반적인 증가는 PI3K-AKT 신호 전달 감소 및 초기 배아 치사율과 일치합니다29,30,31.
다음으로, kd 세포의 AJ 변화에서 PI3K-AKT 신호 전달의 인과적 역할을 확인하기 위해 대조군과 kd 세포의 경로를 화학적으로 변경했습니다(그림 7A-F).우리는 융합 SPECC1L-kd 세포에서 관찰된 세포 모양 변화 표현형을 마커로 사용했으며, 이는 가장 긴 치수(길이)와 해당 수직 치수(너비)의 비율을 사용하여 정량화했습니다.비교적 원형 또는 입방체 세포의 경우 1의 비율이 예상됩니다(그림7G).세포 모양 외에도 β-catenin 염색을 통해 AJ에 미치는 영향도 확인했습니다(그림 7A'-F').wortmannin을 사용한 PI3K-AKT 경로의 억제는 대조 세포(그림 7A,C) 및 AJ(그림 7A')에서 세포 모양을 변경하는 데 충분했습니다.PI3K-AKT 활성화제 SC-79는 대조 세포에서 세포 모양(도 7A, E) 또는 AJ 확장(도 7A')에 영향을 미치지 않았습니다.SPECC1L-kd 세포에서 PI3K-AKT 경로를 추가로 억제하면 세포 사멸이 증가하고 (그림 7B, D) β-catenin 염색이 현저하게 증가했으며 (그림 7B ') 이는 생체 내 중형 돌연변이와 일치합니다.중요한 것은 PI3K-AKT 경로의 활성화가 세포 모양(그림 7B,F)과 AJ 표현형(그림 7B")을 크게 개선했다는 것입니다.세포 형태의 변화를 세포 원형율(CCR)로 정량화하고 상기 기재된 바와 같이 유의성을 비교하였다(도 7G).실제로 대조 세포(그림 7G, CCR = 1.56)에서 wortmannin 처리는 관찰된 것과 유사한 정도로 세포 모양(그림 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9)을 크게 변경하기에 충분했습니다. SPECC1L에서.-kd 세포(그림 7G, CCR = 3.46).SPECC1L-kd 세포(그림 7G, CCR = 3.60, 무시할 수 있음)의 Wortmannin 처리는 처리되지 않은 kd 세포(그림 7G, CCR = 3.46, 무시할 수 있음) 또는 wortmannin 처리 대조 세포(그림 7G)보다 더 중요하지 않았습니다., CCR = 3.46, 무시할 수 있음)은 세포 신장에 추가로 영향을 미칩니다(7G, CCR = 3.61, 무시할 수 있음).가장 중요한 것은 SC-79 AKT 활성화제가 SPECC1L-kd 세포의 길쭉한 표현형을 복원했다는 것입니다(그림 7G, CCR = 1.74, p < 6.2 × 10-12).이러한 결과는 SPECC1L이 PI3K-AKT 신호 전달을 조절한다는 것을 확인하고 SPECC1L의 적당한 감소는 세포 접착에 영향을 미치는 반면, 강한 감소는 세포 사멸을 유도한다는 것을 시사합니다 (그림 8).
(A-F') PI3K-AKT 경로 억제제 워트마닌(C, D) 또는 SC-79 활성화제(E, F)로 처리된 대조군(A, C, E) 및 SPECC1L-kd(B, D, F) 세포 .처리되지 않은 대조 세포는 정상적인 β-cat 세포 염색(A')을 갖는 입방형(A)인 반면, kd 세포는 증가된 β-cat 염색(B')으로 연장됩니다(B).PI3K-AKT 경로를 억제한 후 대조 세포는 β-cat 확장(C')으로 연장된 반면(C'), kd 세포는 고도로 돌연변이된 배아와 유사하고 극도로 강화된 β-cat을 나타내는 세포사멸(D)을 겪기 시작했습니다.염색(D').PI3K-AKT 경로 활성화 후, 대조군 세포는 입방형(E)을 유지하고 정상적인 β-cat(E') 염색을 보인 반면, kd 세포는 상당히 개선된 세포 모양(F) 및 β-cat(F') 염색을 나타냈습니다. (G) MetaMorph 소프트웨어를 사용하여 가장 긴 치수(길이)의 세포 진원도 비율(CCR)과 해당 수직 치수(너비)를 사용하여 (AF)의 세포 모양 변화 정도를 정량화했습니다.처리되지 않은 (NT) SPECC1L-kd 세포 (CCR = 3.46)는 대조군 세포 (CCR = 1.56, p < 6.1 × 10-13)보다 상당히 길었습니다.대조 세포에서 PI3K-AKT 경로의 Wort 억제는 세포 형태에서 유사한 신장을 유발하기에 충분했습니다(CCR=3.61, p<2.4×10-9).유사하게, SPECC1L-kd 세포에서 SC-79에 의한 AKT 활성화는 세포 신장을 제어 수준으로 회복시켰습니다(CCR = 1.74, p < 6.2 × 10-12).SPECC1L-kd 세포의 Wortmannin 처리는 세포사멸을 증가시켰으나 처리되지 않은 kd(CCR=3.46, ns) 또는 Wortmannin 처리된 대조 세포(3.61)와 비교하여 세포 모양 변화(CCR=3.60)의 추가 증가는 관찰되지 않았습니다.ns = 상관없습니다.50개 셀에 대한 +/- SEM 측정값이 표시됩니다.스튜던트 t-테스트를 ​​사용하여 통계적 차이를 계산했습니다.
(A) PI3K-AKT 경로의 억제 및 활성화에 대한 도식적 표현으로 각각 AJ 변화 및 구조가 발생합니다.(B) SPECC1L에 의한 AKT 단백질 안정화를 위해 제안된 모델.
전이성 CNCC는 전방 신경주름 신경상피 세포로부터 분리하기 위해 AJ 용해가 필요합니다1,15,32.AJ 성분의 염색 증가와 시험관 내 및 생체 내 모두에서 SPECC1L 결핍 세포의 정점 기저 AJ 비대칭 분포의 손실은 SPECC1L과 β-카테닌의 물리적 근접성과 결합되어 SPECC1L이 AJ 국소 안정성을 적절히 유지하는 기능을 한다는 것을 시사합니다. 조직 근육.액틴 세포골격.SPECC1L과 액틴 세포골격 및 β-카테닌의 연관성과 SPECC1L이 없는 경우 응축된 액틴 필라멘트 수의 증가는 관찰된 AJ 밀도의 증가와 일치합니다.또 다른 가능성은 SPECC1L이 결핍된 세포에서 액틴 섬유의 수가 증가하면 세포간 장력이 변화된다는 것입니다.세포 스트레스가 AJ 33 역학에 영향을 미치기 때문에 전압 변화로 인해 AJ 34가 더 확산될 수 있습니다.따라서 모든 변경 사항은 CNCC 레이어에 영향을 미칩니다.
Wnt1은 신경 능선 세포를 생성하는 초기 신경 주름에서 발현됩니다.따라서 Wnt1-cre 계보 추적은 NCC35 이전 및 마이그레이션을 모두 표시합니다.그러나 Wnt1은 또한 초기 신경 주름에서 파생된 등쪽 뇌 조직 클론을 표시하므로35,36 개방형 신경 주름에서 Wnt1 마커에 대한 E9.5 돌연변이의 염색은 CNCC가 아닐 가능성이 높습니다.NCC 마커 AP2A 및 SOX10에 대한 우리의 양성 염색은 Specc11 돌연변이 배아의 노출된 신경 주름에 실제로 CNCC가 포함되어 있음을 확인했습니다.또한, AP2A 및 SOX10은 초기 이동 NCC의 마커이기 때문에 양성 염색은 이들 세포가 E9.5에 의해 계층화될 수 없는 이동 후 CNCC임을 나타냅니다.
우리의 데이터는 SPECC1L에 의한 AJ의 분자 조절이 PI3K-AKT 신호 전달에 의해 매개된다는 것을 시사합니다.AKT 신호전달은 SPECC1L 결핍 세포 및 조직에서 감소됩니다.Fantauzzo 등의 연구 결과.두개안면 형태형성에서 PI3K-AKT 신호전달에 대한 직접적인 역할을 지원합니다.(2014)은 PDGFRα 기반 PI3K-AKT 신호 전달의 활성화 부족이 구개열 표현형을 초래한다는 것을 보여주었습니다.우리는 또한 PI3K-AKT 경로의 억제가 U2OS 세포에서 AJ와 세포 모양을 변화시키는 데 충분하다는 것을 보여줍니다.우리의 연구 결과와 일치하여 Cain et al.도 37은 내피 세포에서 PI3K α110 서브유닛의 하향조절이 "연결 지수"의 증가로 지칭되는 세포주위 ​​β-카테닌 염색의 유사한 증가를 가져온다는 것을 보여주었습니다.그러나 액틴 필라멘트가 이미 고도로 조직화되어 있는 내피 세포에서는 PI3K-AKT 경로를 억제하면 세포 모양이 느슨해집니다.대조적으로, SPECC1L-kd U2OS 세포는 길쭉한 세포 형태를 나타냈다.이 차이는 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다.PI3K-AKT 신호전달의 억제는 액틴 세포골격에 영구적으로 영향을 미치는 반면, 세포 모양에 대한 영향은 중심 액틴 섬유의 밀도 및 조직 변화로 인한 장력의 변화에 ​​의해 결정됩니다.U2OS 세포에서는 SPECC1L이 결핍된 AJ 변화 및 회복의 지표로 세포 모양 변화만을 사용했습니다.결론적으로, 우리는 SPECC1L 결핍에서 AKT 경로를 억제하면 AJ 안정성이 증가하고 CNCC에서 박리를 감소시킨다는 가설을 세웁니다.
흥미롭게도, SPECC1L이 없는 경우 인산화된 473-AKT 수준 외에도 pan-AKT 수준이 시험관 내 및 생체 내에서 감소했는데, 이는 AKT 단백질 안정성 또는 회전율 수준에서 PI3K-AKT 신호 전달의 조절을 시사합니다.Opitz/GBBB 증후군과 관련된 SPECC1L 및 MID1 유전자는 미세소관을 안정화하는 단백질을 암호화합니다 18,22.SPECC1L과 MID1이 미세소관 안정화를 중재하는 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다.SPECC1L의 경우 이러한 안정화에는 미세소관 하위 집합의 향상된 아세틸화가 포함됩니다 18 .SPECC1L이 AKT와 같은 다른 단백질을 안정화하기 위해 유사한 메커니즘을 사용하는 것이 가능합니다.AKT 단백질의 라이신 잔기의 아세틸화는 막 위치화 및 인산화를 감소시키는 것으로 나타났습니다38.또한, AKT의 동일한 라이신 잔기에서 K63 사슬의 유비퀴틴화는 막 위치화 및 활성화를 위해 필요합니다.다양한 고처리량 효모 2-하이브리드 스크린에서 확인된 SPECC1L 단백질과 상호 작용하는 여러 요인 중 4가지(CCDC841, ECM2942, APC 및 UBE2I43)가 유비퀴틴화 또는 수모화를 통한 단백질 전환 또는 안정성과 관련이 있습니다.SPECC1L은 AKT 라이신 잔기의 번역 후 변형에 관여하여 AKT 안정성에 영향을 줄 수 있습니다.그러나 AKT 단백질의 국소화 및 안정성에 있어서 SPECC1L의 중요한 역할은 아직 밝혀지지 않았습니다.
생체 내 SPECC1L 발현의 심각한 결함으로 인해 AJ 마커 염색이 증가하고 CNCC 오버레이 결함이 발생했을 뿐만 아니라 세포사멸과 초기 배아 치사율이 증가했습니다.이전 보고서에 따르면 세포사멸 수준이 증가된 마우스 돌연변이는 신경관 결함44,45,46,47 및 두개안면 결함48과 관련이 있는 것으로 나타났습니다.신경 주름이나 인두 궁의 과도한 세포 사멸로 인해 적절한 형태발생 운동에 필요한 세포 수가 부족해질 수 있다고 제안되었습니다48,49,50.대조적으로, SPECC1L 발현이 적당히 감소된 우리의 SPECC1L 결핍 세포주는 증가된 세포 사멸의 증거 없이 AJ 변화만을 보여주었습니다.그러나 이들 Kd 세포에서 PI3K-AKT 경로의 화학적 억제는 세포사멸을 증가시켰습니다.따라서 SPECC1L 발현이나 기능의 적당한 감소는 세포 생존을 보장합니다.이는 st.에서 체포되지 않는 희귀한 Specc11 돌연변이 배아의 관찰과 일치합니다.E9.5(아마도 유전자 포획 효율 감소로 인해)는 신경관을 닫고 나중에 발달을 멈출 수 있으며, 종종 두개안면 결함이 있습니다(그림 S3).또한 이는 두개안면 이상이 있는 이형접합 Specc1 배아의 드문 발생(아마도 유전자 포획 효율의 증가로 인해)과 두 개의 SPECC1L 상동체(specc1lb) 중 하나가 후기 배아 표현형을 유발하는 제브라피시에서의 발견과 일치합니다. 아래턱과 양측 갈라진 틈51.따라서 인간 환자에서 확인된 이형접합성 SPECC1L 기능 상실 돌연변이는 두개안면 형태형성 동안 SPECC1L 기능에 작은 손상을 일으킬 수 있으며 이는 구강안면 틈을 설명하기에 충분합니다.세포간 접촉의 SPECC1L 기반 조절은 또한 인두궁의 구개 형성 및 융합에 역할을 할 수 있습니다.SPECC1L 기능에 대한 추가 연구는 신경상피 세포 운동성 및 두개안면 형태형성에서 신경관 폐쇄 동안 CNCC에서 일시적인 세포간 접촉의 역할을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.
U2OS 골육종 제어 및 SPECC1L-kd 세포는 이전에 기술된 바 있다(Saadi et al., 2011).SPECC1L에 대한 항체도 이전에 특성화되었습니다(Saadi et al., 2011).항-β-카테닌 항체(토끼; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX)(마우스; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 미오신 IIb(1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , 캘리포니아), DLX2(1:1000; Abcam, MA, Cambridge), phospho-Ser473-AKT(1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT(1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67(1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 절단된 카스파제 3(1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) 및 β-액틴(1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 설명된 대로 사용했습니다..액틴 필라멘트는 Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado)으로 염색되었습니다.
U2OS 대조 세포 및 SPECC1L-kd 세포를 10% 소 태아 혈청(Life Technologies, Carlsbad, CA)이 보충된 표준 고글루코스 DMEM에서 배양하였다.AJ 변화의 경우, 0.1% 돼지 젤라틴(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 처리된 유리에 2 x 105개의 세포를 시딩하고 세포 모양의 변화를 관찰했습니다.세포는 서로 다른 표시된 시점에 수집되었습니다: 파종 후 4시간(t = 1), 파종 후 24시간(t = 2), 세포 모양의 변화가 없는 합류(t = 3), 세포 모양의 변화(t = 4) , 세포 모양 변경 후 24시간(t = 5) 및 세포 모양 변경 후 48시간(t = 6)(그림 1, 2, 3).PI3K-AKT 경로를 조절하기 위해 세포를 PI3K-AKT 억제제 wortmannin(TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) 또는 SC-79 활성화제(TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota)와 함께 표시된 농도에서 배양했습니다.화학 물질이 포함된 배지는 매일 교체되었습니다.
정상적인 배양 조건에서 라이브 컨트롤과 KD 세포에 대해 프레임별 기록을 수행하고 위상차 이미지를 7일 동안 10분마다 수집했습니다.이미지는 기계식 스테이지와 QImaging Retiga-SRV 카메라에 연결된 10x N-PLAN 대물렌즈가 장착된 컴퓨터 제어 Leica DM IRB 도립 현미경을 사용하여 획득했습니다.이미징 동안 세포 배양은 5% CO2가 포함된 습한 대기에서 37°C로 유지되었습니다.
지역 돌연변이 마우스 리소스 센터(UC Davis, CA)의 두 유전자 트랩 ES 세포주 DTM096 및 RRH048을 사용하여 Specc1lgtDTM096 및 Specc1lgtRRH046으로 지정된 Specc11 결핍 마우스 라인을 생성했습니다.간략하게, 129/REJ ES 세포를 C57BL6 배반포에 주입하였다.생성된 키메라 수컷 마우스를 암컷 C57BL6 마우스와 교배하여 아구티 코트 착색을 갖는 자손을 확인했습니다.유전자 트랩 벡터 삽입물의 존재는 이형접합체를 식별하는 데 사용되었습니다.마우스는 129/REJ;C57BL6의 혼합 배경에 보관되었습니다.유전자 트랩 벡터의 삽입 위치는 RT-PCR, 게놈 서열 분석 및 유전자 보완을 통해 확인되었습니다 (보충 그림 1).이중 이형접합성 Specc1lGT 마우스의 CNCC 계통을 추적하기 위해 ROSAmTmG(#007576) 및 Wnt1-Cre(#003829) 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)를 교배하여 Specc1l 돌연변이 배아에서 ROSAmTmG 및 Wnt1-Cre 대립유전자를 생성했습니다.쥐를 대상으로 한 모든 실험은 캔자스 대학 의료 센터의 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
배아를 실온에서 60분 동안 (1% 포름알데히드, 0.2% 글루타르알데히드, 2mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5mM EGTA)에 고정시켰습니다.X-gal 염색 용액(5mM 칼륨 페리시안화물, 5mM 칼륨 페로시안화물, 2mM MgCl2, 0.01% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.02% NP-40, 1mg/ml X-gal)에 고정한 후 염색은 37°C에서 수행되었습니다. .1~6시간 이내에 °C.배아를 4% PFA에 사후 고정하고 시각화했습니다.
웨스턴 블롯팅을 위해, HALT 프로테아제 억제제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 혼합물이 보충된 수동 용해 완충액(Promega, Fitchburg, WI)에서 세포를 용해시켰다.용해물을 12% 폴리아크릴아미드 Mini-PROTEAN TGX 기성 젤(Bio-Rad, Hercules, CA)에서 처리하고 Immobilon PVDF 멤브레인(EMD Millipore, Billerica, MA)으로 옮겼습니다.막을 0.1% Tween을 함유하는 PBS 중 5% 우유로 차단했습니다.항체를 4℃에서 밤새 배양하거나 실온에서 1시간 동안 배양하였다.신호 생성에는 Femto SuperSignal West ECL 시약(Thermo Scientific, Waltham, MA)이 사용되었습니다.면역 염색을 위해 배아를 4% PFA/PBS에 밤새 고정하고 냉동보존했습니다.조직 동결절편을 1% 정상 염소 혈청(Thermo Scientific, Waltham, MA) 및 0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이 함유된 PBS에서 차단한 후 배양기에서 4°C로 배양했습니다. 밤.4°C에서 1시간 동안 항항체와 형광 2차 항체(1:1000)를 사용합니다.염색된 부분을 ProLong 금 배지(Thermo Scientific, Waltham MA)에 넣고 Leica TCS SPE 공초점 현미경을 사용하여 평면 이미지를 얻었습니다.각각의 면역염색은 적어도 2개의 돌연변이 배아의 단면에 대한 3개의 독립적인 실험으로 수행되었습니다.대표적인 실험이 표시됩니다.
세포를 변형된 RIPA 완충액(20mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130mM NaCl, 10% 글리세롤, 2mM EDTA 및 HALT 프로테아제 억제제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))에서 배양했습니다. 간략하게, 용해물을 단백질 G 자기 비드(Life Technologies, Carlsbad, CA)로 사전 정제한 다음 항-SPECC1L과 함께 4℃에서 밤새 배양하거나 IgG 단백질 G 단백질 비드를 사용하여 SPECC1L을 추출하고 웨스턴 블롯팅을 항-SPECC1L을 사용하여 수행했습니다. 위에서 설명한 -β-카테닌 항체 표시된 co-IP 실험은 4개의 독립적인 실험을 대표합니다.
고정 배양 세포 또는 마우스 배아 조직을 캔자스 대학 의료 센터의 전자 현미경 센터에 제공했습니다.간단히 말하면, 샘플을 EMbed 812 수지(Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)에 매립하고 60°C에서 밤새 중합한 후 다이아몬드 블레이드가 장착된 Leica UC7 초박절편기를 사용하여 80 nm에서 절단했습니다.단면은 100kV Lab6 건이 장착된 JEOL JEM-1400 투과 전자 현미경을 사용하여 시각화되었습니다.
이 기사를 인용하는 방법: Wilson, NR et al.SPECC1L의 결핍은 접합된 관절의 안정성을 증가시키고 두개골 신경 능선 세포의 박리를 감소시킵니다.과학.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
생잔느, J.-P.신경능선의 유도 및 분화.(Springer Science + 비즈니스 미디어, Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR 외.움직이는 두개골 신경 능선 세포: 두개안면 발달에서의 역할.미국 의학 유전학 저널.파트 A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: 20년에 걸친 성장과 발전.소아과 의사.병리학.실혐실.약.17, 1–25(1997).
Mangold E., Ludwig KU 및 Noten MM 구강안면파열 유전학의 획기적인 발전.분자 의학 동향 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. 및 Riley, FM 두개안면 발달 중 두개 신경 능선 세포 이동 및 패턴화의 분자 메커니즘.개발 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH 및 Murray, JK 구순구개열: 유전적 및 환경적 영향 이해.자연스러운 댓글.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CRet al.인터페론 조절 인자 6(Irf6) 결핍 마우스의 피부, 사지 및 두개안면 부위의 비정상적인 형태 형성.내셔널 제네트.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. 외.GRHL3의 우세한 돌연변이는 반 데르 바르드 증후군을 유발하고 구강 주피의 발달을 손상시킵니다.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ 및 Juriloff, DM 신경관 폐쇄에 결함이 있는 마우스 돌연변이 목록을 업데이트하고 신경관 폐쇄에 대한 완전한 유전적 이해를 향한 진전을 이루었습니다.선천적 결함에 대한 조사.파트 A, 임상 및 분자 기형학 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K 매개 PDGFRalpha 신호 전달은 p53 의존성 세포 내 경로를 통해 골격 발달의 생존과 증식을 조절합니다.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND 및 Murdoch, JN Disheveled: 수렴 확장과 신경관 폐쇄의 관계.신경학의 동향.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).