347 스테인레스 스틸 코일 튜브 화학 성분, 교차 결합 질량 분석기(CLMS)를 사용하여 새로운 인터페론 반응성 인간 백혈구 항원 A(HLA-A) 샤페론 단백질 식별

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제품 설명

스테인레스 스틸 347L 코일 튜브, 강철 등급: SS347L

인터페론 신호 전달 시스템은 환경의 광범위한 병원성 및 내인성 병리학적 신호에 대해 강력한 사이토카인 반응을 유도하여 인터페론 유도성 단백질의 하위 집합을 유도합니다.우리는 인터페론 유도 단백질 영역에서 새로운 단백질-단백질 상호 작용을 탐지하기 위해 DSS 매개 교차 결합 질량 분석법(CLMS)을 적용했습니다.예상되는 인터페론 유도성 단백질 외에도 MX1, USP18, OAS3 및 STAT1과 같은 표준 인터페론 유도성 단백질의 새로운 분자간 및 분자내 가교 부가물도 확인했습니다.우리는 공동 면역 침전을 사용하여 HLA-A 단백질(H2BFS-HLA-A-HMGA1)에 의해 형성된 새로운 인터페론 유도성 단백질 네트워크 세트의 직교 검증과 분자 역학 모델링을 사용한 추가 연구에 중점을 두었습니다.단백질 복합체의 형태 역학 모델링을 통해 CLMS 조사 결과에서 확인된 상호 작용을 반영하는 여러 상호 작용 사이트가 밝혀졌습니다.우리는 함께 인터페론에 의해 유도된 새로운 신호 전달 복합체를 식별하기 위한 CLMS의 파일럿 연구를 제시하고, 종양 미세환경에서 단백질 상호작용의 새로운 역학을 식별하기 위해 CLMS의 광범위한 사용을 기대합니다.
적응 면역 반응이 시작되기 전에 숙주의 선천적 방어 시스템은 인터페론(IFN)이라고 불리는 분비된 알파나선형 사이토카인 계열에 의해 매개되는 항균 반응을 시작합니다.I형 IFN 클래스 IFNα 및 IFNβ는 항바이러스, proapoptotic, 전염증 및 항증식 상태를 포함한 세포 반응을 활성화합니다.인간의 경우 IFNα의 13개 하위 유형이 알려져 있으며 모두 염색체 91에 모여 있습니다. 놀랍게도 IFNα2만이 임상 용도로 연구되었습니다.최근에는 IFNα의 다른 아형에 대한 연구에 특별한 관심이 기울여졌습니다.최근 연구에 따르면 IFNα14는 표준 IFNα2 하위 유형에 비해 HBV2 및 HIV-13,4 복제를 제한하는 데 가장 효과적인 이소형 중 하나입니다.
활성화된 I형 인터페론 수용체 복합체(IFNAR1 및 IFNAR2)가 Janus 키나제 TYK2 및 JAK15,6에 의해 매개되는 신호 전달 계통을 유발한다는 것이 확립되었습니다.이러한 Janus 키나제는 티로신 잔기의 신호 변환기와 전사 단백질 활성제(STAT1 및 STAT2)를 인산화하여 SH2 도메인 매개 이종이합체화를 시작합니다6.그 후, IRF9는 STAT 이종이합체와 결합하여 IFN 자극 인자 3 유전자(ISGF3)의 삼량체 복합체를 형성하며, 이는 핵으로 이동하여 2000개 이상의 인터페론 자극 유전자(ISG)5,6,7,8의 전사를 유도합니다.
ISG는 특히 바이러스 공격에 대응하여 선천성 면역 체계의 중추를 형성합니다.바이러스 감염에 대한 첫 번째 방어선으로서 세포는 광범위한 생물학적 활동과 세포 단백질의 광범위한 상호 작용을 신속하게 전개합니다.이러한 단백질에는 패턴 인식 수용체, 신호 분자, 전사 인자, 직접적인 항바이러스 기능을 갖는 단백질 및 면역 반응의 음성 조절 인자가 포함됩니다9.ISG 활동에 대한 많은 정보는 과발현 스크린10,11 또는 개별 ISG가 발현되거나 억제되고 그 활성이 다양한 바이러스에 대해 테스트되는 유전자 침묵 기술(siRNA, RNAi 및 CRISPR)12,13을 사용하는 기능적 스크린에서 나옵니다.이러한 연구를 통해 개별 ISG의 항바이러스 특성이 밝혀졌지만 각 ISG의 기본 분자 메커니즘은 아직 거의 알려지지 않았습니다.많은 단백질이 완전한 활성을 보장하기 위해 하나 이상의 사이토카인과 상호작용한다는 것이 일반적으로 인정됩니다. 따라서 ISG가 직접 상호작용하거나 상호작용이 세포 단백질에 의해 매개됩니다.예를 들어, 최근의 광가교 단백질체학 연구에서는 ATPase VCP/p97이 주요 IFITM3 상호작용 파트너로 확인되었으며, 이 파트너의 억제는 바이러스 입자와 함께 IFITM3의 리소좀 분류, 회전율 및 공동 수송에 결함을 초래합니다 14 .면역침전을 사용하여 우리는 소포 관련 단백질인 VAPA를 콜레스테롤 매개 바이러스 성숙을 중재하는 IFITM1/2/3과의 상호 작용 파트너로 식별했으며 이는 효모 2-하이브리드 시스템을 사용한 또 다른 연구에서 확인되었습니다.과학적 지원 15, 16.
감염 및 악성 형질전환 억제와 관련된 기본적인 생물학적 과정은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 매개되는 항원 제시입니다.절단되거나 조기에 종료되거나 잘못 접힌 단백질의 펩티드(8-12개 아미노산 길이)는 MHC-I 이종이량체(β-2-마이크로글로불린이라고 불리는 MHC-I 중쇄 및 경쇄로 구성됨, β2M)17,18에 로드됩니다.생성된 안정적인 MHC-I 삼량체는 세포 표면으로 운반되어 CD8+ T 세포(세포독성 T 세포)에 세포내 펩타이드를 제공합니다.T 세포는 이러한 병원체와 종양 특이적 항원을 운반하는 세포를 인식하고 파괴합니다.결과적으로 병원체와 종양 세포는 면역 감시를 피하기 위해 항원 제시 과정을 억제하는 경우가 많습니다.또한 MHC-I은 인간 종양의 40~90%에서 하향 조절되며 종종 예후가 좋지 않습니다19.
병원체에 반응하는 데 관여하는 유전자는 휴식 상태와 활성 전사 상태 사이를 빠르게 전환해야 합니다.따라서 여러 세포 단백질은 프로모터 염색질의 리모델링 및 변형을 포함하여 짧은 기간 동안 높은 IFN 요구에 대한 반응에 관여한다고 가정됩니다 20,21.대부분의 연구는 IFN 존재 하에서 개별 ISG 단백질 파트너를 식별하는 데 중점을 두었습니다.모델 세포 시스템에 대한 여러 단백질체학 및 전사체 연구를 통해 IFN이 세포 환경에 미치는 영향이 밝혀졌습니다.그러나 인터페론에 의해 유발된 역학에 대한 이해가 증가하고 있음에도 불구하고 우리는 여전히 ISG의 참여에 대해 거의 알지 못합니다.인터페론 신호 전달의 복잡성과 시간 의존적 역학을 고려할 때 두 가지 질문이 제기됩니다. (i) 빠른 신호 전달과 관련된 다중 단백질 복합체를 안정화하고 트랩하는 것이 가능하며 (ii) 이러한 상호 작용을 3D 공간에 매핑할 수 있습니까?
이러한 문제를 해결하기 위해 우리는 IFNα 유발 단백질 상호 작용 네트워크와 그 역학을 연구하기 위해 질량 분석기(CLMS)와 결합된 디숙신이미드 하위 매개 화학적 가교(DSS)를 구현했습니다.DSS는 생체 내에서 단백질 및/또는 단백질 복합체의 근위 잔기 사이에 공유 결합을 추가합니다.후속 MS 분석에서는 내부 연결이라고 불리는 특정 단백질 내의 영역 또는 상호관계라고 불리는 단백질 복합체의 하위 단위의 공간적 근접성을 반영하는 특정 교차 결합 부위가 드러납니다.이 접근법을 사용하여 우리는 인터페론에 의해 유도된 다중단백질 상호작용 네트워크뿐만 아니라 몇 가지 새로운 단백질-단백질 복합체를 확인했습니다.이러한 새로운 상호 작용의 하위 집합을 추가로 테스트함으로써 우리는 H2BFS(H2B 히스톤 유형 FS, 이하 H2B라고 함)와 MDN1이 HLA-A의 결합 파트너 역할을 한다는 것을 입증합니다.
Flo-1 세포는 식도 종양의 주요 특징을 모방하기 때문에 식도 선암종의 가장 잘 알려진 시험관 내 모델 중 하나입니다22,23.그러나 모든 종양이 면역원성이 있는 것은 아니며 Flo-1 세포가 인터페론 치료에 반응하는지 확인하기 위해 Flo-1 세포를 10ng/ml IFNα로 72시간 동안 처리했습니다.Flo-1 세포는 치료 후 2시간부터 시작하여 72시간 동안 계속되는 pSTAT1 및 IRF1의 조기 유도를 보여주었으며 IRF1의 고정 수준은 시간에 따라 감소했습니다(그림 1A).ISG(MX1, IFITM1, OAS1/2 및 ISG15)는 6시간 후에 강력하게 유도되어 IFNα에 대한 전형적인 중간 및 후기 단계 반응을 모방하는 것으로 나타났습니다(그림 1A).종합적으로, 이러한 데이터는 이 세포 모델이 인터페론 반응을 연구하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다.
IFNα 처리 후 Flo-1 세포의 차별적 단백질 발현 반응.(A) 2, 6, 24, 48 및 72시간 동안 10ng/ml IFNα로 처리된 Flo-1 세포의 단백질 발현을 표시된 ISG 항체를 사용하여 면역블롯으로 분석했습니다.(B) 표시된 시간과 농도 동안 DSS와 교차 결합한 후 전체 세포 추출물의 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 젤.(C) 단백질 가교 정도를 평가하기 위해 동일한 샘플의 p53(DO-1) 항체로 검사한 대표적인 면역블롯입니다.
현장 단백질 상호 작용 환경을 포착하기 위해 우리는 높은 막 투과성과 상대적으로 짧은 반응 시간으로 인해 널리 사용되는 가교제인 DSS를 사용했습니다.반응 시간이 짧을수록 가교된 단백질의 큰 응집체가 형성되는 것을 방지하여 가교제의 안정성을 유지하는 데 도움이 됩니다.최적의 DSS 농도를 결정하고 과도한 가교를 방지하기 위해 먼저 세포를 각각 5, 10, 5 및 30분 동안 5, 2.5 및 1mM DSS에 노출시킨 후 쿠마시 염색 SDS-PAGE로 용해물을 분석했습니다. (데이터는 표시되지 않음) .세포 용해물은 가장 낮은 농도와 가장 짧은 시점에서 고도로 가교된 것으로 보입니다.따라서 DSS는 5분에 걸쳐 1, 0.5 및 0.1 mM로 적정되었습니다(그림 1B).최적의 가교결합은 0.5mM DSS에서 5분 동안 관찰되었으며, 이러한 조건은 IFNα로 처리된 세포에 대해 선택되었습니다.또한, 그림 1C는 단백질 가교 정도를 평가하기 위해 p53(DO-1) 항체를 사용하여 수행한 웨스턴 블롯을 보여줍니다.
Flo-1 세포를 10ng/ml IFNα로 24시간 동안 처리한 후 가교제를 첨가했습니다.가교된 세포는 이후 2단계 단백질 분해에 의해 용해되었고 단백질은 FASP에 의해 처리되었습니다(그림 2)24,25.가교결합된 트립신 펩티드를 질량 분석법으로 분석했습니다(그림 2).그런 다음 MS/MS 스펙트럼을 단백질 서열과 일치시키고 MaxQuant26,27로 정량화합니다.SIM-XL 프로그램을 사용하여 얻은 스펙트럼에서 교차 연결된 펩타이드를 식별하고 xQuest28 및 SIM-XL29 오픈 소스 컴퓨팅 소프트웨어 파이프라인을 사용하여 개별 화합물을 복잡한 네트워크로 결합했습니다(그림 2).SIM-XL은 단순하거나 복잡한 단백질 혼합물에서 단백질 간 상호 작용, 내부 사슬 및 개별 사슬을 식별하고 단백질 구조의 상호 작용을 시각화하기 위한 스크립트를 제공합니다.또한 MS/MS29 스펙트럼 품질에 따라 각 상호 참조의 순위를 ID 점수로 매깁니다.몇 가지 매우 신뢰할 수 있는 단백질-단백질 상호작용 및 복합체가 확인되었으며, 분자 역학(MD) 모델링을 사용하여 공동 면역침전 및 복합체의 형태 변화를 사용하여 새로운 상호작용 세트가 추가로 조사되었습니다(그림 2) 30, 31.
CLMS 방법의 도식적 개요.Flo-1 세포를 24시간 동안 10ng/ml IFNα로 처리한 후 DSS를 사용한 현장 단백질 가교결합, 이어서 세포 용해 및 트립신화를 수행했습니다.Orbitrap 질량 분석기를 사용하여 가교된 샘플을 분석하고 LC-MS/MS 동안 펩타이드 전구체의 단편화를 위해 추가로 샘플링했습니다.SIM-XL(Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides) 프로그램을 사용하여 얻은 스펙트럼에서 두 개의 연결된 펩타이드를 식별하고 모든 화합물을 컴퓨터 파이프라인을 사용하여 복잡한 네트워크로 결합했습니다.FDR(false positive rate) 점수를 기준으로 신뢰도가 낮은 상호 작용을 필터링합니다.몇 가지 새로운 고충실도 단백질-단백질 상호 작용이 공동 면역침전을 사용하여 추가로 확인되었으며, 분자 역학(MD) 모델링을 사용하여 복합체의 구조 변화를 조사했습니다.
자극되지 않은 IFNα 샘플과 자극된 IFNα 샘플에서 각각 MaxQuant를 사용하여 총 ~30,500개 및 ~28,500개의 펩타이드가 검출되었습니다(보충 표 S1, 그림 3A).두 경우 모두의 펩타이드 길이 분포는 더 큰 펩타이드의 비율이 더 높았으며 이는 교차 결합 펩타이드의 존재를 나타냅니다 (그림 3B, C).또한 IFNα 처리 샘플의 40-55 범위에는 더 큰 비율의 더 큰 펩타이드가 존재했습니다 (그림 3C).log2 강도에 대한 단백질 매핑은 MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 및 HLA-F를 포함하여 처리되지 않은 샘플에 비해 고전적인 인터페론 자극 단백질이 가장 풍부하다는 것을 보여주었습니다(그림 3D).Reactome 경로 데이터베이스를 사용하여 IFNα 처리에 반응하여 3배 이상 강화된 단백질에 대한 경로를 분석한 결과 MHC-I 매개 항원 제시 및 처리가 가장 지배적인 경로인 것으로 나타났습니다(그림 3E).이전 보고서와 일치하게, OAS 및 ISG15뿐만 아니라 IFNα/β 및 사이토카인 신호 전달에 의해 매개되는 항바이러스 반응이 활성화된 경로 중 하나였습니다.또한 SIM-XL을 사용하여 원래 획득한 MS/MS 스펙트럼에서 라이신 및 세린 특이적 단백질 교차 결합이 확인되었습니다.최근 연구에서는 5개 세포 유형에 대한 개별 ISG 과발현 연구에 대한 메타 분석을 통해 9개 바이러스 클래스의 20개 바이러스에 걸쳐 104개의 ISG가 보고되었습니다9.그러나 대규모 데이터 세트 스크리닝의 계산적 한계를 극복하기 위해 우리는 Padaria 등이 보고한 IRDS 유전자 목록(대부분 ISG) 간의 가능한 상호 작용을 탐색하기 위해 더 작은 데이터 세트로 시작했습니다.
IFNα에 반응하여 차등적으로 발현된 가교 단백질의 식별(MaxQuant에서 얻은 데이터)(A) IFNα14 처리 및 처리되지 않은 Flo-1 샘플에서 확인된 공통 및 독점 펩티드의 수를 나타내는 벤 다이어그램.처리되지 않은(B) 및 IFNα 처리된(C) 가교된 샘플의 펩티드 길이 분포.(D) 처리되지 않은 Flo-1 세포와 IFNα14 처리된 Flo-1 세포 사이의 log2(LFQ 강도)를 나타내는 히트 맵.왼쪽 패널은 IFNα 존재 시 가장 활발하게 활성화되는 단백질을 보여줍니다.(E) IFNα 처리 후 20가지 주요 농축 경로를 나타내는 히스토그램.Reactome 경로 데이터베이스는 상향 조절된 IFNα 반응 단백질의 4배 이상의 변화를 분석했습니다.
인터페론 매개 ISG 자극은 잘 문서화되어 있지만 분자 수준에서는 이러한 단백질이 광범위한 생물학적 기능에서 어떻게 정점에 도달하는지 잘 이해되지 않습니다.우리는 알려진 ISG 간의 높은 신뢰도로 단백질 상호 작용을 조사했습니다.흥미롭게도 우리는 IFNα 치료에 반응하여 큰 복합체를 형성하는 MX1, USP18, ROBO1, OAS3 및 STAT1 단백질을 포함하는 네트워크를 확인했습니다(그림 4, 표 S2)32,33,34.가장 중요한 것은 이러한 상호작용이 IFNα로 처리된 모든 삼중 실험에서 발견되었으며 처리되지 않은 샘플에서는 발견되지 않았으며 이는 IFNα 처리에 반응하여 특이적으로 형성되었음을 시사합니다.STAT1은 이러한 ISG의 발현을 전사적으로 조절하는 것으로 알려져 있지만, 단백질 수준에서 ISG와의 상호작용은 연구되지 않았습니다.STAT1의 결정 구조는 이합체 형성 중에 나선형 도메인(CCD)이 DNA 또는 프로토머와의 상호 작용에 관여하지 않는다는 것을 보여주었습니다.이러한 α-나선은 상호작용이 발생하도록 주로 친수성 표면적을 제공하는 나선형 나선 구조를 형성합니다 35 .CLMS 데이터에서 우리는 STAT1과의 상호 작용의 대부분이 CCD, 링커 도메인 또는 C 말단 꼬리(잔기 700-708) 이전의 SH2 도메인에서 발생했음을 관찰했습니다(그림4A).이전 연구에서는 USP18이 STAT2의 CCD 및 DNA 결합 도메인(DBD)에 결합하고 I형 인터페론 수용체 IFNAR2의 하위 단위에 모집되어 I형 인터페론 신호 전달의 억제를 중재한다고 보고했습니다24.우리의 데이터는 또한 USP18 촉매 도메인이 STAT1 DBD와 상호 작용한다는 것을 보여 주었으며(그림 4A,D), 이는 STAT1과 STAT2가 모두 USP18을 IFNAR2로 유인하는 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
IFNα로 처리된 가교 세포에서 확인된 단백질-단백질 ISG 네트워크.(A) 단백질-단백질 상호 작용(SIM-XL 프로그램에서 생성됨)을 보여주는 2D 상호 작용 플롯과 분자간 상호 작용을 나타내는 선(교차 결합 컷오프가 3.5로 설정됨).다양한 ID의 도메인은 색상으로 표시됩니다32: MX1 도메인, Dynamin_N(73–249), Dynamin_M(259–547) 및 GED(569–660).OAS3 도메인: OAS1_C(160-344), OAS1_C(559-745), NTP_transf_2(780-872) 및 OAS1_C(903-108).도메인 ROBO1, Ig_3(67–151), I-set(170–258), I-set(262–347), Ig_3(350–432), Ig_3(454–529), fn3(562–646), fn3 (678–758) 및 fn3 (777–864).STAT1 필드: STAT_int(2–120), STAT_alpha(143–309), STAT_bind(321–458), SH2(573–657) 및 STAT1_TAZ2bind(715–739).(B)교차 결합된 단백질(MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 및 STAT1)의 원형 뷰어와 상호 작용 및 상호 작용이 각각 파란색과 빨간색으로 표시되어 있습니다.교차 연결 임계값은 3.5로 설정되었습니다.도트 플롯은 MX1(C), USP18(D), ROBO1(E) 및 OAS3(F)과의 STAT1 상호작용 사이트뿐만 아니라 두 펩타이드 사이의 K 또는 S 상호작용 사이트를 나타냅니다.그림에서 교차 연결 점수 임계값은 3.0으로 설정됩니다.(G) PyMol(PyMOL 분자 그래픽 시스템, 버전 2.0 Schrödinger, LLC.)의 단백질 구조에 중첩된 STAT1과 OAS3 DI 도메인 사이의 다양한 상호 작용 사이트;STAT1(pdb ID: 1bf533) 및 OAS3(pdb ID: 4s3n34).) 프로그램.
USP18의 두 가지 동형이 인간에서 기술되었는데, 하나는 주로 핵에 위치하는 전장 단백질이고, 다른 하나는 N 말단 도메인이 없는 동형 USP18-sf로 세포질과 핵에 고르게 분포되어 있습니다 36 .또한, N-말단은 구조화되지 않은 것으로 예측되었으며 이소펩티다제 활성 또는 ISG1537 결합이 필요하지 않습니다.우리 연구에서 확인된 상호 작용의 대부분은 단백질의 N 말단에 위치했으며, 이는 이러한 상호 작용이 전장 USP18(그림 4A,D)을 포함하므로 핵에서 발생할 가능성이 있음을 시사합니다.더욱이, 우리의 데이터는 N-말단이 단백질 간 상호작용에 특화되어 있음을 나타냅니다.IFNAR2 결합 부위는 잔기 312-368 사이에 위치하며, 특히 복합체 내 단백질 중 어느 것도 이 영역에 결합하지 않습니다(그림 4A)37,38.종합적으로 취합된 이러한 데이터는 IFNAR2 결합 도메인이 수용체 단백질에 의해 독점적으로 사용된다는 것을 나타냅니다.또한, OAS3 및 ROBO1만이 N 말단 및 IFNAR2 결합 부위의 상류 도메인과 연관되어 있는 것으로 밝혀졌습니다(그림 4A).
ROBO1은 막관통 신호 분자의 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리에 속하며 세포외 영역에 5개의 Ig 도메인과 3개의 피브로넥틴(Fn) 도메인으로 구성됩니다.이러한 세포외 도메인 뒤에는 막 근위 영역과 단일 막횡단 나선(39)이 옵니다. 구조화되지 않은 세포내 영역은 C 말단에 위치하며 이펙터 단백질 결합을 중재하는 보존된 서열 모티프를 포함합니다.아미노산 ~1100에서 1600까지 확장된 영역은 대부분 무질서합니다.우리는 MX1이 Ig, Fn 및 세포 내 도메인을 통해 ROBO1과 상호 작용하는 반면 STAT1과의 대부분의 상호 작용은 CCD, 링커 도메인 및 ROBO1의 C 말단 사이에서 발생한다는 것을 발견했습니다(그림 4A, E).반면, DI, DIII 및 OAS3 링커 영역과의 상호작용은 ROBO1 단백질 전반에 걸쳐 분포되었습니다(그림 4A).
OAS(oligoadenylate synthase) 단백질 계열은 세포 내 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 수용하고 결합하며 형태 변화를 겪고 2',5'-연결된 올리고아데닐산염(2-5 As) 40을 합성합니다.세 가지 OAS 중에서 OAS3은 dsRNA에 대해 가장 높은 친화력을 나타내며 RNase L을 활성화하여 바이러스 복제를 제한할 수 있는 2-5 As를 가장 적은 양으로 합성하는 것으로 나타났습니다41.OAS 계열은 중합효소 베타(pol-β) 유사 뉴클레오티드 전이효소 도메인으로 구성됩니다.이전 연구에서는 C 말단 도메인(DIII)의 촉매 활성이 OAS342 활성화에 필요한 dsRNA 결합 도메인(DI)에 의존한다는 것을 보여주었습니다.우리는 OAS3의 DI 및 DII 도메인이 CCD 및 SH2와 STAT1 TAD 사이의 작은 접합 영역과 상호 작용한다는 것을 관찰했습니다(그림4A,F).단백질 구조에 서로 다른 가교 부위를 겹쳐 놓으면 β-시트와 DBD STAT1 루프와 OAS3의 DI 도메인에 있는 잔기 60-75에 의해 형성된 열린 포켓 또는 공동 사이의 상호 작용이 나타납니다(그림 4G).복합체 내 단백질의 방향은 또한 OAS3과의 상호작용 중 어느 것도 DI 도메인의 DNA 결합 능력을 방해하지 않음을 나타냅니다(그림 S1A).또한 GTPase MX1의 N 말단 도메인은 OAS3의 DI 및 DIII 도메인과 광범위하게 상호 작용합니다(그림 4A).우리는 또한 단일 OAS1 도메인(또한 촉매 활성)이 세 개의 MX1 도메인 모두와 상호 작용하는 세 가지 IFNα 처리 반복에서 OAS1과 MX1 사이의 상호 작용을 관찰했습니다(그림 S2A, B).
MX 단백질은 GTP에 결합하고 가수분해하는 N 말단 GTPase 도메인, 자기 조립을 매개하는 중간 도메인, 그리고 GTPase 역할을 하는 C 말단 류신 지퍼를 포함하는 대규모 디네인 유사 GTPase 계열의 일부입니다(LZ ).도메인 이펙터 도메인25,43.MX1은 바이러스 중합효소의 하위 단위에 결합하여 바이러스 유전자의 전사를 차단합니다.이전에 보고된 효모 2-하이브리드 스크린에서는 PIAS1 관련 MX1이 DNA 결합 활성을 차단하여 STAT1 매개 유전자 활성화를 억제하고 SUMO E344,45 리가제 활성도 가지고 있음을 보여주었습니다.여기서는 MX1이 STAT1에 결합한다는 것을 보여줍니다(그림 4C,D). 그러나 이 상호 작용이 IFNα에 반응하여 STAT1 매개 유전자 활성화에 어떻게 영향을 미치는지는 추가 연구가 필요합니다.또한 우리는 또한 MX1이 세 가지 IFNα 처리 반복 모두에서 IFIT3 및 DDX60과 상호 작용한다는 것을 발견했습니다(그림 S2C).
DDX60은 이전에 바이러스 RNA46의 RIG-I 독립적 분해에 역할을 하는 것으로 보고된 IFN 유도 세포질 헬리카제입니다.이는 RIG-I과 상호작용하고 리간드 특이적 방식으로 신호 전달을 활성화합니다46. DDX60은 DEXD/H-Box 헬리카제 도메인과 바이러스 RNA 및 DNA를 결합하는 C-말단 헬리카제 도메인으로 구성됩니다.MX1 및 IFIT3과의 상호작용의 대부분은 표준 도메인이나 모티프가 없는 긴 N- 및 C-말단 영역 내에서 발생합니다(그림 S2E,F).그러나 MX1은 DEXD/H-Box 헬리카제 도메인과도 연관되어 있습니다(그림 S2E).IFIT 계열의 단백질은 테트라펩타이드 반복(TPR)이라는 독특한 나선-회전-나선 모티프의 직렬 복사본을 가지고 있습니다.IFIT3은 RIG-I 신호 전달의 양성 조절자이므로 MAVS 복합체의 구성 요소인 것으로 밝혀졌습니다.종합하면, 우리의 데이터는 IFIT3과 DDX60이 주로 IFIT3의 TPR 3-6 사이의 영역에서 상호 작용하고 RIG-I/MAVS 신호 전달에서 역할을 할 수 있음을 시사합니다(그림 S2F).
전체 프로테옴을 스크리닝하는 것이 계산 집약적이라는 점을 고려하여 IFNα 처리 반복 중 하나가 있는지 전체 인간 UniProt 데이터베이스를 스크리닝했습니다.이 복제본에서 우리는 HLA-A에 대해 매우 안정적인 여러 상호 작용 네트워크를 발견했습니다.MS/MS 스펙트럼으로 확인된 단백질 경로 분석은 MHC-I 기반 항원 처리 및 제시가 인터페론에 의해 유도되는 주요 경로임을 보여주었습니다(그림 3D).따라서 우리는 모든 가교 샘플에서 높은 신뢰도로 MHC-I 분자의 단백질 상호 작용을 연구하는 데 중점을 두었습니다.HLA는 α1, α2 및 α3 도메인과 경쇄로 구성되며 마이크로글로불린 β2(β2m)는 불변 샤페론 단백질입니다49.일단 소포체에 조립되면 HLA는 펩타이드 리간드가 없으면 불안정합니다.펩타이드 결합 홈은 비펩타이드 형태의 고도로 다형성이고 구조화되지 않은 α1 및 α2 도메인과 상대적으로 덜 다형성인 α351 도메인에 의해 형성됩니다.IFNα가 있는 경우 두 개의 HLA-A 복합체가 발견되었습니다. 하나는 HMGA1 및 H2B(그림 5, 표 S3)와 상호 작용하고 다른 하나는 MDN1, LRCH4 및 H2B(그림 6)와 상호 작용합니다.
IFNα는 H2B(H2BFS) 및 HMGA1과 HLA-A 상호작용 네트워크를 유도합니다.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 복합체의 다양한 유형의 상호 작용을 묘사하는 2D 플롯(SIM-XL 소프트웨어에서 생성됨): 인터링크(파란색), 인터링크(빨간색) 및 단일 링크(검은색)..서로 다른 ID의 도메인은 색상으로 구분됩니다32: H2B(히스톤; 2–102) 및 MHC-I(MHC_1; 25–203, 그룹 C1; 210–290 및 MHC_I_C; 337–364).교차 연결 임계값은 3.5로 설정되었습니다.도트 플롯은 H2B(B) 및 HMGA1(C)과의 HLA-A 상호작용 부위뿐만 아니라 두 펩타이드 사이의 K 또는 S 상호작용 부위를 나타냅니다.그림에서 교차 연결 점수 임계값은 3.0으로 설정됩니다.(D) PyMOL 프로그램에서 H2B, HLA-A 및 HMGA1 단백질의 구조에 표시된 단백질 간의 관계.이러한 구조는 Phyre2 서버(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)를 사용하여 모델링되었으며 H2B, HLA-A 및 HMGA1 단백질의 템플릿 구조는 각각 1kx552, 1kj349 및 2eze55였습니다.
IFNα는 H2B(H2BFS), MDN1 및 LRCH4와 HLA-A 상호작용 네트워크를 유도합니다.(A) MDN1이 원으로 표시되는 2D 대화형 맵(SIM-XL 소프트웨어에서 생성됨)에 표시되는 분자 내(빨간색) 및 분자 간(파란색) 가교.교차 연결 임계값은 3.5로 설정되었습니다.서로 다른 ID의 도메인은 색상으로 구분됩니다32: H2B(히스톤; 2–102), MHC-I(MHC_1; 25–203, 그룹 C1; 210–290 및 MHC_I_C; 337–364) 및 LRCH4(LRR_8(68–126), LRR_8(137–194) 및 CH(535–641)).(B) PyMOL 프로그램에서 H2B, HLA-A, LRCH4 및 MDN1 단백질의 구조에 표시된 단백질 간의 관계.이러한 구조는 H2B, HLA-A, LRCH4 및 MDN1 단백질에 대한 템플릿 구조 1kx552, 1kj349, 6hlu62 및 6i2665를 사용하여 Phyre2 서버(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)를 사용하여 모델링되었습니다. 각기.H2B(C), LRCH4(D) 및 MDN1(E)과 HLA-A에 대한 K 또는 S 상호작용 사이트를 보여주는 도트 플롯.플롯의 경우 교차 링크 점수 임계값은 3.0으로 설정되었습니다.
게놈의 무결성을 유지하는 것 외에도 히스톤 H2B는 전사 조절에도 관여합니다.H2B 단백질은 루프로 분리된 3개의 α-나선과 C-말단 꼬리로 형성된 중앙 히스톤 도메인(HFD)으로 구성됩니다.H2B와의 상호작용의 대부분은 HFD 이종이량체와의 삼량체화를 제공하는 α1 나선에서 발생합니다(그림 5A, B).리신은 DNA 결합에 관여하지만 일부 리신은 대체 아세틸화 또는 메틸화 부위이기도 합니다.예를 들어, H2B의 잔기 K43, K46 및 K57은 직접적인 DNA 결합에 관여하지 않지만 다양한 전사 후 변형의 표적입니다.유사하게, H2B의 잔기 K44, K47 및 K57은 다른 단백질과의 상호작용을 포함하여 IFNα가 있는 경우 대체 역할을 할 수 있습니다(그림 5A, B).또한 염색체외 히스톤 H2B는 다양한 세포 유형에서 면역 반응을 활성화하여 감염원이나 손상된 세포에서 유래한 이중 가닥 DNA(dsDNA) 단편을 감지하는 세포질 센서 역할을 합니다.DNA 바이러스가 있는 경우 H2B 고갈은 IFN-β 생산과 STAT154 인산화를 억제했습니다.H2B는 또한 다른 핵심 히스톤54보다 빠르게 핵 안팎으로 이동하는 것으로 알려져 있습니다.MDN1 및 LRCH4와의 H2B 상호작용도 선택된 미처리 샘플에서 관찰되었습니다.우리는 HLA-A가 세 가지 IFNα 처리 샘플 모두와 하나의 처리되지 않은 반복 샘플에서 H2B와 상호 작용한다는 것을 발견했습니다.이러한 데이터는 전사 조절과 무관한 대체 생리적 기능에서 H2B의 역할을 반영합니다.
질병을 촉진하는 아미노산이 풍부한 작은 핵단백질인 HMGA1(고 이동성 그룹 AT-Hook 1)이 HLA-A와 연관되어 있는 것으로 확인되었습니다.이것은 dsDNA55,56에서 AT가 풍부한 영역의 작은 홈에 결합하기 때문에 산성 C 말단 꼬리와 AT 후크라고 불리는 세 개의 별개의 DBD를 가지고 있습니다.이 결합으로 인해 DNA가 구부러지거나 곧게 펴져 표준 전사 인자가 합의 서열에 접근할 수 있게 됩니다.C-말단 결실 돌연변이체는 전사를 개시할 수 없기 때문에 C-말단 꼬리는 단백질-단백질 상호작용 및 전사 인자 동원에 관여하는 것으로 여겨진다.더욱이, 이 도메인은 키나아제의 기질로 알려진 몇 가지 보존된 인산화 부위를 포함합니다58.우리는 C-말단 도메인 외부의 HMGA1과 HLA-A 및 H2B 상호작용을 관찰했는데, 이는 C-말단 도메인이 전사 인자 결합에 주로 사용된다는 것을 시사합니다(그림 5A, C).HMGA 단백질은 어댑터 DNA에 결합하기 위해 히스톤 H1과 경쟁하여 접근성을 높입니다.유사하게, HMGA는 히스톤 H1과 경쟁하여 링커 DNA를 따라 히스톤 H2B와 상호작용하는 것 같습니다.HMGB1은 수지상 세포에서 HLA-A, -B 및 -C의 발현을 유도하여 활성화되지만59 HMG와 HLA 간의 상호 작용은 이전에 보고된 바가 없습니다.우리는 HMGA1이 HLA-A의 α1 및 α3 도메인과 상호 작용하며 대부분의 상호 작용이 3 DBD 외부에서 발생한다는 것을 발견했습니다(그림 5A,C).우리 손에서 HLA-A는 핵에 국한되어 있는 것으로 밝혀졌으며(데이터는 표시되지 않음) H2B와 HMGA1도 핵에 존재한다는 점을 고려하면 이러한 상호 작용은 핵에서 발생할 가능성이 높습니다.H2B, HLA-A 및 HMGA1 사이에서 측정된 특정 부가물은 그림 5D에 표시됩니다.
HLA-A와 다른 단백질의 대부분의 상호작용은 α1 및 α2 도메인과 무질서한 C-말단 도메인 내에서 발생합니다(그림 6).이러한 예 중 하나에서 우리는 HLA-A가 LRCH4의 무질서한 N 말단 꼬리와 상호 작용한다는 것을 발견했습니다(그림 6A,D).LRCH4는 TLR4 활성화 및 LPS 사이토카인 유도를 조절하여 선천적 면역 반응을 조절합니다.이는 엑토도메인에 9개의 류신이 풍부한 반복부(LRR)와 칼모듈린(CH) 상동성 모티프가 있고 이어서 막횡단 도메인(TMD)이 있는 막 단백질입니다60, 62.CH 도메인은 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 것으로 보고되었습니다60.LRR과 CH 도메인 사이의 약 300개 아미노산 구간은 상대적으로 접근 가능하지만 무질서합니다.단백질-단백질 네트워크 및 소포 수송의 매개자로서 무질서한 영역의 기능에 기초하여, 우리는 대부분의 단백질 상호작용이 무질서한 영역에서 발생한다는 것을 발견했습니다.MDN1과의 상호작용은 LRR1, LRR6, CH 도메인 및 무작위 영역을 포함하여 단백질 길이 전반에 걸쳐 분포된 반면, H2B는 주로 CH 도메인에 결합했습니다(그림 6A, B).특히, 상호작용 중 어느 것도 TMJ를 포함하지 않았으며, 이는 CLMS 접근법의 특이성을 시사합니다(그림 6A, B).
MDN1은 또한 HLA-A 단백질 네트워크의 일부로 확인되었습니다(그림 6A).이는 AAA 단백질 계열(다양한 활동과 관련된 ATPase)에 속합니다.이는 6합체 고리로 구성되고 60S 64 리보솜 하위 단위에서 조립 요소를 제거하는 동일한 N 말단 AAA 도메인입니다.dynein64,65,66과 유사한 것으로 보입니다.또한 Asp/Glu 풍부 영역 다음에는 MIDAS 도메인(금속 이온 의존성 사이트)이 옵니다.MDN1은 크기가 크고(약 5600개의 아미노산) 잘 연구된 단백질과의 제한된 상동성으로 인해 인간에서의 구조와 기능에 대해 알려진 바가 거의 없습니다.우리는 HLA-A, H2B 및 LRCH4를 MDN1 결합 파트너로 식별하고 PyMol에서 단백질 복합체로서의 방향을 밝혔습니다 (그림 6A, B).이 세 가지 단백질은 AAA 도메인, 다인 유사 링커 도메인 및 MIDAS MDN1 도메인과 상호작용합니다.이전 보고서에서 미끼 단백질의 친화성 정제는 MDN1이 히스톤 H2B67과 관련된 단백질로 확인되었습니다.또한, 최근 연구에서는 친화성 정제 질량 분석법을 사용하여 HCT116 세포에서 MDN과 HLA-B 사이의 상호 작용이 보고되었으며, 이는 우리의 연구 결과를 뒷받침합니다68.IFNα 처리 샘플에서 이 복합체의 식별은 인터페론 신호 전달에서 MDN1의 역할을 시사합니다.
HLA 유전자는 매우 다형성이 높기 때문에 Flo-1 세포의 RNA 시퀀싱 데이터에서 HLA-A, -B 및 -C를 매핑하는 시퀀싱 읽기를 추출했습니다(데이터는 표시되지 않음).시퀀싱 판독과 일치하는 펩타이드 서열은 교차 연결된 펩타이드가 HLA-A에 위치한 영역에서 HLA-A, -B 및 -C 사이에 유의미한 차이를 나타냈습니다(그림 S3).또한, 우리는 H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 단백질과 HLA-B/C 분자의 단백질 간 교차 결합을 관찰하지 못했습니다.이는 HLA-A, MDN1, LRCH1 및 HMGA1 사이에서 발견되는 단백질 상호작용이 HLA-A에 특이적임을 시사합니다.또한, 비가교 샘플의 단백질체 분석(표 S4)은 HLA-A가 HLA-B 또는 HLA-C에 비해 더 높은 서열 범위를 갖는 것으로 나타났습니다.HLA-A에 대해 확인된 펩티드는 IFNα 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플 모두에서 강도가 높았습니다.
여기에서 확인된 상호 작용이 공간적으로 가까운 두 단백질의 비특이적 교차 결합으로 인한 것이 아닌지 확인하기 위해 공동 면역 침전 분석을 수행하여 두 가지 새로운 HLA-A 상호 작용 요인을 추가로 확인했습니다.내인성 MDN1 및 H2B와의 HLA-A 상호 작용은 IFNα 처리 및 처리되지 않은 Flo-1 세포 모두에서 감지되었습니다 (그림 7, 그림 S4).우리는 HLA-A가 면역침전물에서 H2B에 의해 포획되었음을 확인했으며, 처리되지 않은 세포의 면역침전물 샘플에는 HLA-A가 없었기 때문에 이러한 연관성은 IFNα 처리로 인한 것임을 확인했습니다(그림 7A).그러나 우리의 데이터는 IFNα가 H2B 및 MDN1에 대한 HLA-A 결합을 차별적으로 조절한다는 것을 시사합니다.IFNα는 H2B와 HLA-A 사이의 결합을 유도하지만 MDN1과의 결합을 감소시킵니다.우리는 MDN1이 대조군에서 HLA-A와 연관되어 있고 IFNα를 첨가하면 IFNα에 의한 MDN1 유도와 관계없이 이 상호 작용이 감소한다는 것을 발견했습니다(그림 7B,C).또한, HLA-A 면역침전은 A549 세포에서 H2B를 포착했으며(그림 S4), 이는 이 상호작용이 세포 유형과 무관함을 시사합니다.종합하면, 이러한 결과는 HLA-A와 H2B 및 MDN1의 인터페론 매개 상호 작용을 뒷받침합니다.
HLA-A는 H2B와 MDN1을 공동 정화합니다.대표적인 내인성 H2B(A) 및 MDN1(B) 면역블롯을 IFNα 처리된 Flo-1 세포로부터 면역침전시키고 표시된 항체를 조사했습니다.마우스 및 토끼 IgG를 음성 대조군으로 사용했습니다.(C) 다양한 항원의 상대적인 양(입력)은 표시된 항체에 대해 프로빙된 면역블롯으로 표시되며, β-액틴은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다.
인터페론으로 유도된 신뢰성 높은 가교 네트워크 중 하나인 H2B-HLA-A-HMGA1의 구조적 특성을 조사했습니다.우리는 이 복합체에 관련된 단백질의 구조적 역학을 이해하기 위한 대체 접근법으로 분자 역학 모델링을 사용했습니다(그림 8).CLMS 데이터로부터의 추론은 H2B, HLA-A 및 HMGA1 단백질의 다양한 형태의 가능성을 시사합니다.따라서 H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A 및 H2B-HLA-A-HMGA1과 같은 잠재적 복합체가 용매 매질에서 모델링되었습니다.MOE(Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) 패키지를 사용한 초기 단백질-단백질 도킹 화면은 이러한 단백질 간에 다른 가능한 형태를 제안했습니다(그림 8A).도킹 단백질 복합체의 시각화를 통해 여러 상호 작용과 가능한 형태가 밝혀졌습니다(그림 5A, 8).따라서 하나의 가능한 형태가 그림 8A(가교 링크 표시)에 표시되어 있으며 MD 모델링 파이프라인을 사용하여 추가로 평가되었습니다.또한, H2B 또는 HMGA1이 HLA-A에 결합하면 HLA-A에 대한 H2B의 더 높은 친화력이 강조됩니다(그림 8A).
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A 및 H2B-HLA-A-HMGA1 복합체 사이의 가능한 네트워크의 구조 역학.(A) 왼쪽 패널은 분자 내(빨간색) 및 분자 간(파란색) 가교(교차 링크 컷오프가 3.5로 설정됨)의 2D 맵(SIM-XL 소프트웨어에서 생성됨)입니다.또한, 확인된 가교 잔기는 H2B, HLA-A 및 HMGA1 단백질의 구조에 표시되어 있습니다.이러한 단백질의 관련 형태는 MOE 패키지에 구현된 도킹 파이프라인을 사용하여 추출되었습니다.왼쪽 하단 패널은 다양한 단백질-단백질 결합 친화도(GBVI/WSA dG; kcal/mol)를 갖는 H2B-HLA-A 및 HMGA1-HLA-A 복합체의 다양한 가능한 형태를 보여줍니다.(B) 각 단백질 구조에 대한 원자 위치(수소 원자 제외)의 표준 편차(RMSD).(C) 지속 시간 ≥ 10ns의 특정 상호 작용을 고려한 다양한 시뮬레이션 복합체의 분자간 단백질-단백질 수소 결합 상호 작용.h-결합 공여체-수용체 컷오프 거리는 3.5Å으로 설정되었고, 공여체-H-수용체 컷오프 각도는 ≥ 160°–180°로 설정되었습니다.(D) 더미 HLA-A-H2B 및 HLA-A-HMGA1 복합체에서 추출된 ≥ 20ns에 걸쳐 각각의 파트너와 HLA-A 단백질-단백질 상호 작용을 형성하는 표지된 잔류물입니다.단백질 구조는 100ns MDS의 평균 구조를 나타냅니다.(E) HLA-A-H2B와 HLA-A-HMGA1 복합체 사이의 상호 작용은 두 펩타이드 사이의 K 또는 S 상호 작용 사이트를 기반으로 100ns 이상 H2B-HLA 시뮬레이션으로 추적된 상호 작용과 비교됩니다.복합체 /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.교차 연결 평가를 위한 임계값은 3.0으로 설정되었으며 ≥ 10ns를 취하는 MDS의 특정 상호 작용이 고려되었습니다.단백질 구조는 BIOVIA Discovery Studio(Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) 및 Molecular Operating Environment(MOE, Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) 패키지를 사용하여 시각화되었습니다.
시간 경과에 따른 HLA-A 분자의 안정성(표준 편차, RMSD 또는 표준 편차, RMSF)은 복합체에 H2B 또는 HMGA1 단백질이 존재하면 HLA-A가 안정화되었음을 나타냅니다(그림 8B, 그림 S5).HMGA1 단백질은 HLA-A의 B2M 부위에 단단히 결합하여 HLA-A-HMGA1 또는 H2B-HLA-A-HMGA1 복합체에서 HLA-A 아미노산의 안정성을 유도합니다(그림 8B, 그림 S5).특히, HLA 잔기 ~60-90 및 ~180-210은 H2B의 존재 하에 유연성이 떨어지는 것으로 밝혀졌습니다(도 8B).H2B 및 HMGA1은 H2B 또는 HMGA1 단독에 결합하는 HLA-A와 비교하여 H2B-HLA-A-HMGA1 복합체에서 HLA-A에 더 나은 결합을 보여주었습니다(그림 8C,D; 표 S5).수소 결합에 관련된 잔류물(MD는 10ns 이상의 높은 점유율을 모델링함)이 복합체의 CLMS 상호 작용 사이트(K 또는 S 잔류물)와 일치하며, 이는 CLMS에 의해 식별된 상호 작용이 매우 신뢰할 수 있음을 시사합니다.신뢰성(도 8E).CLMS 및 MD 모델링에서, 약 190-210개 및 약 200-220개 아미노산 사이의 HLA-A 잔기가 각각 H2B 및 HMGA1에 결합하는 것으로 밝혀졌습니다(도 8E).
단백질-단백질 상호작용은 특정 자극에 반응하여 세포내 의사소통을 중재하는 동적 구조 네트워크를 형성합니다.많은 단백질체학 접근법은 단백질의 전반적인 정상 상태 수준의 변화를 감지하기 때문에 단백질-단백질 상호 작용 역학은 결합 인터페이스를 포착하기 위한 추가 도구가 필요하며 CLMS는 그러한 도구 중 하나입니다.인터페론 신호 전달 시스템은 세포가 다양한 환경 병원성 및 내인성 병리학적 신호에 반응하여 인터페론 유도성 단백질의 하위 집합을 유도할 수 있도록 하는 사이토카인 네트워크입니다.우리는 인터페론 유발 단백질 패널에서 새로운 단백질-단백질 상호작용이 확인될 수 있는지 확인하기 위해 CLMS를 적용했습니다.인터페론 반응성 Flo-1 세포 모델의 전체 단백질 가교 분석을 사용하여 단백질 복합체를 포착했습니다.비가교 및 가교 세포에서 트립신 펩티드를 추출하면 정의된 LFQ 강도로 펩티드 계산, 경로 농축 및 펩티드 길이 분포가 가능합니다.표준 인터페론 유도성 단백질은 양성 내부 대조군으로 확인되었으며, MX1, UP18, OAS3 및 STAT1과 같은 표준 인터페론 유도성 단백질의 새로운 분자간 및 분자내 가교 부가물이 관찰되었습니다.기능 영역의 다양한 구조적 특징과 상호 작용이 조사되었습니다.
HLA-A, MDN1 및 H2B 사이의 상호작용은 IFNα로 처리된 및 처리되지 않은 Flo-1 및 A549 세포에서 면역블로팅에 의해 검출되었습니다.우리의 결과는 HLA-A가 IFNα 의존적 방식으로 H2B와 복합체를 형성한다는 것을 강조합니다.우리의 작업은 이 두 단지의 공동 지역화에 대한 추가 탐구를 위한 흥미로운 방법을 나타냅니다.세포 유형에 독립적인 인터페론 매개 단백질 상호 작용을 확인하기 위해 CLMS 접근 방식을 세포주 패널로 확장하는 것도 흥미로울 것입니다.마지막으로, 우리는 분자 내 및 분자간 누화를 추적하는 H2BFS-HLA-A-HMGA1 복합체에 관련된 단백질의 구조 역학을 이해하기 위한 대체 접근법으로 MD 모델링을 사용했습니다.CLMS 데이터로부터의 추론은 H2BFS, HLA-A 및 HMGA1 단백질의 다양한 형태의 가능성을 시사합니다.이러한 도킹 단백질 복합체 사이의 가능한 다른 형태는 CLMS 데이터 세트에서 관찰된 것과 유사한 여러 상호 작용을 나타냅니다.우리 방법의 주요 강점 중 하나는 HLA와 같은 고도로 다형성 유전자의 상호 작용을 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다. 따라서 연구하기 어려운 HLA 일배체형 특이적 단백질의 상호 작용을 연구하는 것이 흥미로울 것입니다.종합하면, 우리의 데이터는 CLMS가 인터페론 유발 신호 네트워크에 대한 이해를 확장하고 종양 미세 환경에서 보다 복잡한 세포간 시스템을 연구하기 위한 기초를 제공하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.
Flo-1 세포는 ATCC에서 얻어 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen), 10% 소 태아 혈청(Gibco)이 보충된 DMEM(Gibco)에서 유지하고 37°C 및 5% CO2에서 보관했습니다.잠복.IFNα14(Edinburgh Protein Production Facility에서 제조)로 처리하기 전에 세포를 70-80% 합류점까지 성장시켰습니다.다른 모든 화학 물질 및 시약은 달리 명시되지 않는 한 Sigma Aldrich에서 구입했습니다.
Flo-1 세포를 6웰 플레이트에서 배양하고 다음날 세포를 대략 80% 컨플루언스까지 24시간 동안 10ng/ml IFNα14로 처리했습니다.세포를 PBS로 3회 세척하고 PBS 중 새로 제조된 DSS(Thermo Fisher Scientific)(DMSO에 용해됨)와 37℃에서 5분 동안 최종 농도가 0.5mM이 되도록 결찰시켰습니다.DSS 가교 반응을 PBS로 대체하고 PBS 중 20mM Tris(pH 8.0)를 37°C에서 15분 동안 첨가하여 잔류 DSS를 켄칭했습니다.세포를 긁어서 수집하고 저결합 튜브(Axygen)에 수집했습니다.
세포 펠릿을 300 μl의 요소 용해 완충액(8 M 요소, 0.1 M Tris, pH 8.5)으로 실온에서 30분 동안 가끔 흔들면서 용해시켰습니다.모든 원심분리 단계는 8°C에서 14,000 xg로 수행되었습니다.용해물을 10분간 원심분리하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.남은 투명 입자를 150μl의 2차 용해 완충액(2M 요소, 2%(w/v) SDS(나트륨 도데실 황산염))에 균질한 수용액이 얻어질 때까지 30분 이상 용해시켰습니다.용해물을 20분간 원심분리한 후 상등액을 이전 단계에서 얻은 용해물과 혼합했습니다.마이크로플레이트 절차에 대한 제조업체의 지침에 따라 Micro BCA 분석(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 단백질 농도를 평가했습니다.샘플을 액체 질소에서 급속 냉동하고 -80°C에서 보관했습니다.
Wisniewski et al.이 설명한 대로 수정된 여과 시료 준비 프로토콜(FASP)을 사용하여 약 100μg의 가용성 가교 단백질을 처리했습니다.69 간단히 말하면, 단백질은 200μl의 요소 완충액(0.1M Tris 중 8M 요소, pH 8.5)으로 가교결합되고, 와류되고 반으로 나뉩니다.모든 원심분리 단계는 25°C에서 14,000 xg로 수행되었습니다.가교된 단백질 용해물의 전반부를 Ultracel-10 멤브레인(Merck)이 장착된 10 kDa Microcon 원심분리 필터 장치에 옮긴 후, 필터 위에서 25분간 원심분리하였다.그런 다음 단백질의 나머지 절반을 필터에 추가하고 동일한 단계를 반복하십시오.요소 완충액에 17mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(TCEP) 100μl를 첨가하여 단백질 회수를 수행했습니다.회수물을 열혼합기에서 600rpm으로 37℃에서 30분 동안 교반했습니다.또한, 컬럼을 원심분리하고, 요소 완충액에 용해된 50 mM iodoacetamide 100 μl를 사용하여 환원된 가교 단백질을 알킬화하였다.알킬화 반응은 실온에서 암실에서 20분 동안 수행하였다.컬럼을 회전시키고 컬럼 벽을 100 µl 요소 완충액으로 3회 세척한 후 원심분리합니다.100mM 암모늄 중탄산염 100μl를 사용하여 동일한 작업을 3회 수행하였다.트립시니화하기 전에 수집 튜브를 새 것으로 교체하십시오.트립신 완충액(Promega)에 희석된 50mM 중탄산암모늄과 1μl 트립신을 함유한 소화 완충액을 추가합니다.트립신 대 단백질의 비율은 약 1:33으로 유지되었고 소화 반응은 습한 챔버에서 37℃로 밤새 배양되었습니다.25분 동안 원심분리에 의해 가교결합된 펩타이드를 필터로부터 용출시켰다.50 μl의 0.5 M NaCl을 필터에 첨가한 후 25분간 원심분리하여 펩타이드 회수율이 향상되었습니다.
C18 Micro Spin 컬럼(Harvard Apparatus)을 사용하여 Bouchal et al.70에 의해 설명된 프로토콜에 따라 약간의 수정을 거쳐 교차 결합된 트립신 펩타이드의 염을 제거했습니다.간략하게, C18 스핀 컬럼은 아세토니트릴(AcN)(Merck) 중 0.1% 포름산(FA)으로 3회 세척하고 0.1% FA로 2회 세척하여 활성화되었습니다.컬럼을 0.1% FA로 15분 동안 수화시켰습니다.샘플을 스핀 컬럼에 로드하고 0.1% FA로 3회 세척합니다.탈염된 펩타이드는 0.1% FA에서 50%, 80% 및 100% AcN을 사용하여 단계적 구배로 순차적으로 용출되었습니다.잔류 액체가 완전히 사라질 때까지 샘플을 SpeedVac Plus 농축기(Eppendorf)에서 건조했습니다.용출된 펩타이드를 2.5% AcN에 용해된 0.08% 트리플루오로아세트산 100μl에 용해시키고 NanoDrop 2000(Thermo Scientific)에서 농도를 측정했습니다.샘플당 약 1μg의 가교결합된 펩타이드를 LC-MS/MS 시스템에 주입했습니다.
교차결합된 펩타이드는 Orbitrap Exploris 480 질량 분석기(Thermo Scientific)에 연결된 UltiMate 3000 RSLCnano LC 시스템(Thermo Scientific)에서 분리되었습니다.가교결합된 펩타이드는 C18 PepMap100 흡착제와 5μm PepMap 흡착제(Thermo Scientific)가 충전된 300μm ID, 5mm 길이의 μ-프리컬럼 C18 캡처 컬럼에서 수집되었습니다.2.5% AcN에 용해된 5 μl/min 0.08% 트리플루오로아세트산으로 설정된 펌프 흐름을 로드합니다.가교된 펩타이드는 내부 직경이 75μm이고 길이가 150mm이고 2μm PepMap 흡착제(Thermo Scientific)가 채워진 분석용 융합 실리카 컬럼에서 분리되었습니다.이동상 A와 B는 각각 물 중 0.1% FA와 아세토니트릴 중 0.1% FA로 구성되었습니다.변화도는 2.5% B에서 시작하여 90분에 걸쳐 40% B까지 선형적으로 증가한 다음 다음 2분에 걸쳐 90% B까지 증가합니다.이동상 조성은 10분 동안 90% B로 유지된 후 2분에 걸쳐 2.5% B로 선형적으로 감소했습니다.컬럼을 다음 주기 전에 8분 동안 2.5% B에서 평형화했습니다.분석 컬럼에서 용출된 가교 펩타이드를 NSI(나노전기분무 이온화) 소스에서 이온화하고 Exploris 480 질량 분석기(Thermo Scientific)에 주입했습니다.
Orbitrap Exploris 480 질량 분석기는 양성 데이터 상관 모드에서 작동되었습니다.m/z 350 Th에서 m/z 2000 Th까지의 범위 설정을 사용하여 120,000의 해상도로 섹션 모드에서 전체 스캔을 수행했습니다.정규화된 AGC 목표는 최대 입력 시간 50ms로 300%로 설정되었습니다.펩타이드에 대한 단일동위원소 피크 검출이 확립되었습니다.전구체가 너무 적으면 제약 완화 매개변수가 true로 설정됩니다.전구체의 최소 이온 강도는 5.0e3으로 설정되었으며 최대 +8의 전구체 전하 상태가 실험에 포함되었습니다.
데이터 상관 모드에서 주요 스캔 간의 주기 시간은 2.5초로 설정되었습니다.동적 질량 배제는 전구체 이온의 첫 번째 단편화 후 20초로 설정되었습니다.전구체 분리 창은 2Th로 설정되었습니다.고정된 충돌 에너지 모드를 사용하는 정규화된 충돌 에너지 유형은 데이터 종속 MS/MS 스캔에서 선택되었습니다.충돌 에너지는 30%로 설정되었습니다.Orbitrap 해상도는 15,000으로 설정되었고 AGC 목표는 100%로 설정되었습니다.사용자 정의 최대 주입 시간은 60밀리초로 설정됩니다.
교차 연결된 샘플에서 단백질-단백질 네트워크를 추적하기 전에 MaxQuant 패키지(버전 1.6.12.0)26,27를 사용하여 원시 파일을 처리하여 샘플에서 추적 가능한 펩타이드/단백질을 식별했습니다.또한, IFNα로 처리된 및 처리되지 않은 가교결합되지 않은 Flo-1 샘플에 대해 유사한 단백질체 분석을 수행했습니다.MS/MS 데이터는 내장된 검색 엔진 Andromeda27을 사용하여 UniProt 인간 데이터베이스(www.uniprot.org)(2020년 8월 12일 업로드, 75,093개 항목 포함)에서 검색되었습니다.검색은 효소의 특이성과 탈아미드화(N, Q) 및 산화(M)의 다양한 변형을 나타내지 않고 수행되었습니다.전구체 질량 허용 오차는 20ppm, 생성 이온은 0.02Da로 설정되었습니다.초기 및 최대 질량 편차는 10ppm으로 설정되었습니다.펩타이드의 최대 질량은 4600Da로 설정되었고 서열 유사성은 7~25개의 아미노산(aa)으로 설정되었습니다.Perseus 프로그램(버전 1.6.10.45)을 사용하여 추가 통계 분석을 수행했습니다.단백질 함량은 단백질의 스펙트럼 강도(LFQ 강도, 비표지 정량화)를 정규화하여 계산하고 강도 값을 Log2로 변환했습니다.펩타이드 강도로 식별된 단백질의 계층적 클러스터링은 R(v 4.1.2)의 pheatmap(v1.0.12) 패키지를 사용하여 구축되었습니다.미처리 샘플에 비해 4배 이상 활성화된 IFNα 처리 단백질에 대한 Reactome 경로 데이터베이스를 사용하여 경로 농축 분석을 수행했습니다.
LC-MS/MS로 모니터링한 단백질 복합체의 리신(K) 또는 세린(S) 특정 화학적 가교의 식별은 교차 연결된 펩타이드(SIM-XL)에 대한 분광 식별 기계(SIM-XL)를 사용하여 수행되었습니다.첫째, Padariya et al.28에 기술된 IRDS 단백질 데이터 세트를 사용하여 인터페론 관련(IFN) DNA 손상 저항 특성(IRDS) 유전자 간의 가능한 상호 작용을 조사했습니다.전체 인간 UniProt의 모든 조건과 반복을 선별하는 것은 계산 집약적이므로 IFNα 처리 반복에 대해 전체 인간 UniProt 데이터베이스(www.uniprot.org)(2020년 8월 12일 다운로드, 75,093개 항목 포함)를 사용합니다.높은 신뢰 상호작용을 위한 필터 중 하나입니다.얻은 이러한 중요도가 높은 상호 작용은 모든 반복 및 조건에서 확장되고 테스트되었습니다.
SIM-XL에서는 가교제(XL)로 DSS를 사용하였고, XL 체중 이동과 변형 체중 이동은 각각 138.06과 156.07로 설정하였다.리포터 이온이 없는 KK, KS 및 KN-TERM과 같은 가교 반응 부위가 고려됩니다.전구체와 조각ppm은 모두 20으로 설정되었고 Xrea 임계값은 0.15로 설정되었습니다.트립신은 완전히 특이적인 것으로 간주되어 고에너지 C-트랩(HCD) 단편화 방법이 구현되었습니다.XCorr 동적 DB 감소 임계값과 동적 DB 감소를 위한 최소 펩타이드 수는 각각 2.5와 2로 설정되었습니다.다른 매개변수는 단일동위원소 확률 및 피크 일치 컷오프, 가닥당 최소 4개의 AA 잔기 및 최대 가닥 전하, 누락된 분할의 최대 3개입니다.결과로 연결된 2D 지도는 (SIM-XL)에서 분석되었으며 xQuest28 그래픽 표현을 사용하여 2D 지도를 구축했습니다.단백질 구조의 단백질 가교는 PyMol(PyMOL Molecular Graphics System, 버전 2.0 Schrödinger, LLC)에서 제공됩니다.
단백질 모델 구조는 "Hidden Markov Method"의 상동성 모델링 및 구현 원리를 사용하여 Phyre2 서버(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11를 사용하여 생성되었습니다.Phyre2는 알려진 단백질 구조와의 서열 정렬을 기반으로 모델 구조를 생성합니다.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 및 MDN1 단백질의 경우 템플릿 구조 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 및 6i2665가 사용되었습니다.또한 AlphaFold71 MX1, UBP18 및 ROBO1의 구조도 고려되었습니다.단백질 구조는 BIOVIA Discovery Studio Visualizer 패키지(Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) 및 Molecular Operating Environment 패키지(MOE, Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada)를 사용하여 시각화되었습니다.