347 12.7*1.24mm 스테인레스 스틸 코일 튜브, 동기식 정전기 응축 및 α-시누클레인 및 타우 응집의 분자 메커니즘

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347 스테인레스 스틸 파이프 사양

347 12.7*1.24mm 스테인레스 스틸 코일 튜브

외부 직경: 6.00mm OD 최대 914.4mm OD, 최대 24" 크기 NB 재고 있음, OD 크기 강철 튜브 재고 있음

SS 347 파이프 두께 범위: 0.3mm – 50mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S 등(0.5-12mm) 또는 필요에 따라 맞춤화할 수 있는 비정규 크기

유형: SS 347 이음매 없는 파이프 |SS 347 ERW 파이프 |SS 347 용접 파이프 |SS 347 가공 파이프 |SS 347 CDW 튜브, LSAW 파이프/심 용접/재인발

형태: SS 347 원형 파이프/튜브, SS 347 사각 파이프/튜브, SS 347 직사각형 파이프/튜브, SS 347 코일 튜브, SS 347 “U” 모양, SS 347 팬 케이크 코일, SS 347 유압 튜브

길이: 단일 무작위, 이중 무작위 및 필수 길이 끝: 일반 끝, 경 사진 끝, 트레드

끝단 보호: 플라스틱 캡 |외부 마감: 2B, No.4, No.1, No.8 스테인레스 스틸 파이프용 미러 마감, 고객 요구 사항에 따라 마감

배송 조건 : 소둔 및 산세, 광택 처리, 광택 소둔, 냉간 압연

검사, 테스트 보고서: 공장 테스트 인증서, EN 10204 3.1, 화학 보고서, 기계 보고서, PMI 테스트 보고서, 육안 검사 보고서, 제3자 검사 보고서, NABL 승인 실험실 보고서, 파괴 테스트 보고서, 비파괴 테스트 보고서

포장: 나무 상자, 비닐 봉투, 강철 스트립 묶음 또는 고객 요청에 따라 포장

특장점 : 상기 이외의 사이즈 및 사양도 요청시 제작 가능

SS 347 파이프 크기 범위:1/2인치 NB, OD ~ 24인치

ASTM A312 347: 고온 및 일반 부식성 서비스용으로 제작된 이음매 없는 직선 심 용접 오스테나이트 파이프입니다.용접 중에는 필러 금속이 허용되지 않습니다.

ASTM A358 347: 부식성 및/또는 고온 서비스용 전기 융합 용접 오스테나이트계 파이프.일반적으로 이 사양에 따라 최대 8인치의 파이프만 생산됩니다.용접 중에 용가재를 첨가하는 것이 허용됩니다.

ASTM A790 347: 응력 부식 균열에 대한 저항성에 특히 중점을 두고 일반 부식 서비스용으로 제작된 이음매 없는 직선 심 용접 페라이트/오스테나이트(이중) 파이프입니다.

ASTM A409 347: 부식성 및/또는 높은 벽 Sch5S 및 Sch 10S를 갖춘 14"~30" 크기의 직선 심 또는 나선형 심 전기 융합 용접 대구경 오스테나이트 경량 벽 파이프

ASTM A376 347: 고온 응용 분야를 위한 이음매 없는 오스테나이트계 파이프.

ASTM A813 347: 고온 및 일반 부식성 응용 분야를 위한 단일 심, 단일 또는 이중 용접 오스테나이트 파이프.

ASTM A814 347: 고온 및 일반 부식성 서비스를 위한 냉간 가공 용접 오스테나이트 파이프.

347H 스테인레스 스틸 파이프 화학 성분

스테인레스 스틸 347H 파이프 기계적 성질

스테인레스 스틸 347H 파이프 물리적 특성

347H 스테인레스 스틸 파이프에 해당하는 등급

아밀로이드 알파-시누클레인(αS) 응집은 파킨슨병 및 기타 시누클레인병증의 특징입니다.최근 알츠하이머병과 일반적으로 연관된 타우 단백질은 αS 병리와 연관되어 있으며 αS가 풍부한 함유물에 공존하는 것으로 밝혀졌지만 두 단백질의 응집에 대한 분자 메커니즘은 아직 불분명합니다.우리는 여기서 αS 상이 타우와 같은 양전하를 띤 폴리펩티드와의 정전기적 복합 응축을 통해 액체 응축물로 분리된다는 것을 보고합니다.다중양이온에 대한 αS의 친화성과 응고 네트워크의 원자가 고갈 속도에 따라 혈전은 빠른 겔화 또는 유착을 겪은 후 느린 아밀로이드 응집을 겪습니다.일련의 고급 생물물리학적 기술을 결합함으로써 우리는 액체-액체 αS/Tau 상 분리를 특성화하고 액체 단백질 응축물에 두 단백질을 모두 포함하는 이종 응집체의 형성으로 이어지는 주요 요인을 식별할 수 있었습니다.
막 구획 외에도 액체-액체 상분리(LLPS)로 알려진 과정을 통해 생체분자 응축물 또는 액적이라고 불리는 단백질이 풍부하고 액체와 같은 조밀한 몸체를 형성함으로써 세포의 공간적 분리를 달성할 수도 있습니다.이러한 물방울은 일반적으로 단백질이나 단백질과 RNA 사이의 다가 시간적 상호작용에 의해 형성되며 거의 모든 생명체에서 다양한 기능을 수행합니다.다수의 LLP 가능 단백질은 본질적으로 매우 무질서하고 생체분자 응축물3,4,5의 형성에서 매우 무질서한 낮은 복잡성의 서열을 나타냅니다.수많은 실험 연구를 통해 이러한 액체형 응축물을 구성하는 단백질의 유연성, 종종 무질서 및 다가 특성이 밝혀졌지만, 이러한 응축물이 보다 고체형으로 성장하고 성숙하도록 제어하는 ​​특정 분자 결정 요인에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 상태..
새로운 데이터는 비정상적인 단백질에 의한 LLPS와 물방울의 고체 구조로의 변형이 종종 퇴행성 질환의 특징인 불용성 독성 집합체의 형성으로 이어지는 관련 세포 경로일 수 있다는 가설을 뒷받침합니다.종종 고도로 전하되고 유연한 많은 LLPS 관련 본질적 장애 단백질(IDP)은 오랫동안 아밀로이드 응집 과정을 통해 신경변성과 연관되어 왔습니다.특히, FUS7 또는 TDP-438과 같은 생체분자 IDP 응축물이나 hnRNPA19와 같이 복잡성이 크고 복잡한 도메인을 가진 단백질은 유동화라는 과정을 통해 젤 같은 형태 또는 심지어 고체 형태로 노화되는 것으로 나타났습니다.화합물.시간의 함수로 또는 특정 번역 후 변형이나 병리학적으로 중요한 돌연변이에 반응하여 고상 전이(LSPT)로 전환됩니다1,7.
생체 내에서 LLPS와 관련된 또 다른 IDP는 아밀로이드 응집이 알츠하이머병과 관련되어 있지만 최근 파킨슨병(PD)에도 관련되어 있는 미세소관 관련 무질서 단백질인 Tau이며, 기타 시냅스 핵 단백질병증도 관련되어 있습니다11, 12, 13.타우는 유리한 정전기 상호작용으로 인해 용액/세포질에서 자발적으로 해리되어 정전기 코아세르베이트라고 알려진 타우가 풍부한 방울이 형성되는 것으로 나타났습니다.또한 이러한 유형의 비특이적 상호작용이 자연의 많은 생체분자 응축물 뒤에 있는 원동력이라는 것도 관찰되었습니다15.타우 단백질의 경우, 정전기적 응집은 단백질의 반대 전하를 띤 영역이 절단 과정을 촉발하는 단순 응집에 의해 형성될 수도 있고, RNA와 같은 음전하를 띤 중합체와의 상호작용을 통한 복합 응집에 의해 형성될 수도 있습니다.
최근 PD 및 시누클레인병증17,18으로 통칭되는 기타 신경퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 IDP인 α-시누클레인(αS)이 유체와 같은 행동을 보이는 단백질 응축물에 집중된 세포 및 동물 모델에서 입증되었습니다.시험관 내 연구에 따르면 αS는 주로 소수성 상호 작용을 통해 단순한 응집에 의해 LLPS를 겪는 것으로 나타났습니다. 하지만 이 과정에는 예외적으로 높은 단백질 농도와 비정형적으로 긴 배양 시간이 필요합니다.생체 내에서 관찰된 αS 함유 응축물이 이 공정에 의해 형성되는지 아니면 다른 LLPS 공정에 의해 형성되는지는 아직 해결되지 않은 주요 문제로 남아 있습니다.마찬가지로 αS 아밀로이드 응집이 PD 및 기타 시누클레인병증의 뉴런에서 관찰되었지만 αS가 세포내 아밀로이드 응집을 겪는 정확한 메커니즘은 불분명합니다. 왜냐하면 이 단백질의 과발현이 이 과정을 자체적으로 유발하는 것으로 보이지 않기 때문입니다.추가적인 세포 손상이 필요한 경우가 종종 있으며, 이는 세포 내 αS 아밀로이드 어셈블리의 핵 재생을 위해 특정 세포 위치 또는 미세 환경이 필요함을 시사합니다.특히 응집되기 쉬운 세포 환경 중 하나는 단백질 응축물 내부일 수 있습니다 23 .
흥미롭게도, αS와 타우는 파킨슨병 및 기타 시누클레인병증이 있는 인간의 특징적인 질병 내포물에 공존하는 것으로 밝혀졌으며24,25 실험에서는 두 단백질 사이의 시너지 병리학적 관계가 보고되었으며26,27 이는 응집 αS와 타우 사이의 잠재적인 관계를 시사합니다. 신경퇴행성 질환의 타우.병.αS와 타우는 시험관 내 및 생체 내에서 상호작용하고 서로의 응집을 촉진하는 것으로 밝혀졌으며 28,29 이들 두 단백질로 구성된 이종 응집체는 시누클레인병증 환자의 뇌에서 관찰되었습니다 30.그러나 αS와 tau 사이의 상호작용의 분자적 기초와 그 공동 응집 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.αS는 αS의 고도로 음전하를 띤 C 말단 영역과 양전하를 띤 잔기가 풍부한 타우의 중앙 프롤린이 풍부한 영역 사이의 정전기적 인력을 통해 타우와 상호 작용하는 것으로 보고되었습니다.
이 연구에서 우리는 αS가 폴리-L-라이신(pLK)과 같은 다른 양전하를 띤 폴리펩티드와의 상호 작용과 대조적으로 타우 단백질이 있는 경우 정전기적 복합체 응축을 통해 실제로 액적으로 해리될 수 있음을 보여줍니다.αS는 액적 네트워크의 지지체 분자 역할을 합니다.우리는 코아세르베이트 네트워크에 관련된 단백질 상호 작용의 원자가 및 강도의 차이와 관련된 정전기적 αS 코아세르베이트의 성숙 과정에서 눈에 띄는 차이점을 확인했습니다.흥미롭게도 우리는 수명이 긴 액체 코아세르베이트에서 αS와 타우 아밀로이드 단백질의 공동 응집을 관찰하고 그러한 코아세르베이트에서 이 두 단백질의 공동 응집으로 이어지는 몇 가지 주요 요인을 확인했습니다.여기에서 우리는 질병 특이적 내포물에서 두 단백질의 공존을 뒷받침하는 가능한 분자 메커니즘인 이 과정을 자세히 설명합니다.
αS는 중성 pH에서 높은 음이온성 C-말단 꼬리를 가지고 있으며(그림 1a), 우리는 이것이 다가양이온성 무질서 폴리펩티드 분자와 정전기적 복합체의 응축을 통해 LLPS를 겪을 수 있다는 가설을 세웠습니다.우리는 중성 pH 32에서 양으로 하전되고 무질서한 고분자 특성으로 인해 100 잔기 폴리-L-리신(pLK)을 시작 모델 분자로 사용했습니다. 먼저, pLK가 용액 NMR 분광법을 통해 αS의 Ct 도메인과 상호 작용한다는 것을 확인했습니다. (그림 1b) 증가하는 αS:pLK 몰 비율이 있는 상태에서 13C/15N으로 표지된 αS를 사용합니다.pLK와 αS의 Ct 도메인의 상호작용은 화학적 이동의 교란과 단백질의 이 영역에서 피크 강도의 감소로 나타납니다.흥미롭게도 αS와 pLK를 대략 αS 농도로 혼합했을 때.폴리에틸렌 글리콜(5~15% PEG-8)(일반적인 LLPS 완충액: 10mM HEPES pH 7.4, 100mM NaCl, 15% PEG-8)이 있는 상태에서 5~25μM의 단백질 형성 과정을 즉시 진행했습니다. .형광 (WF) 및 명 시야 (BF) 현미경을 사용하여 물방울을 관찰했습니다 (그림 1c).농축된 αS(1μM AlexaFluor488 표시 αS, AF488-αS 추가)를 포함하는 1~5μm 액적의 정전기 특성은 10% 1,6-헥산디올(1,6-HD)에 대한 저항성과 다음 민감도에서 파생될 수 있습니다. NaCl 농도의 증가 (그림 1c).αS/pLK 정전기 복합체의 코아세르베이트의 유체와 같은 특성은 밀리초 내에 융합되는 능력으로 입증됩니다(그림 1d).탁도법을 사용하여 이러한 조건에서 액적의 형성을 정량화하고 안정성과 관련된 주요 상호 작용의 정전기적 특성을 확인했으며(그림 1e), LLPS 공정에 대한 다양한 폴리머 비율의 영향을 평가했습니다(그림 1f).다양한 범위의 폴리머 비율에서 액적 형성이 관찰되지만, pLK가 αS를 초과할 때 공정이 매우 유리합니다.LLP는 또한 화학적으로 다른 치환제인 dextran-70(70kDa)을 사용하거나 유리 슬라이드 방울, 다양한 재료의 마이크로플레이트 웰, Eppendorf 또는 석영 모세관을 포함한 다양한 샘플 형식을 사용하여 관찰되었습니다.
이 연구에 사용 된 WT-αS 및 ΔCt-αS 변종의 다양한 단백질 영역에 대한 도식적 표현.양친매성 N 말단 도메인, 소수성 아밀로이드 형성(NAC) 영역 및 음전하를 띤 C 말단 도메인은 각각 파란색, 주황색 및 빨간색으로 표시됩니다.WT-αS의 NCPR(순 잔류량당 요금) 맵이 표시됩니다.b 거대분자 덩어리가 없는 경우 αS/pLK 상호작용의 NMR 분석.pLK 농도가 증가함에 따라(1:0.5, 1:1.5 및 1:10의 αS:pLK 몰비가 각각 연한 녹색, 녹색 및 진한 녹색으로 표시됨).c LLPS 완충액(상단) 또는 500mM NaCl(왼쪽 하단)이 보충된 25μM(WF 이미징의 경우 1μM AF488 표시 αS 또는 Atto647N 표시 pLK)에서 코아세르베이트 αS/pLK(몰비 1:10) 또는 10분 후 % 1,6-헥산디올(1,6-HD; 오른쪽 하단).스케일 바 = 20 μm.d 25μM 농도에서 αS/pLK(몰비 1:10)의 BF 액적 융합의 대표적인 현미경 이미지;화살표는 200ms 이내에 개별 방울(빨간색 및 노란색 화살표)이 새로운 방울(주황색 화살표)로 병합되는 것을 나타냅니다.스케일 바 = 20 μm.e 25μM αS에서 500mM NaCl 또는 10% 1,6-HD를 첨가하기 전과 후의 LLPS 완충액에서 광산란(350nm) αS/pLK 응집(N = 3개의 샘플 반복, 평균 및 표준 편차도 표시됨).f αS:pLK 몰비가 증가하면서 25μM αS에서 αS/pLK 응집의 BF 이미지(상단) 및 광산란 분석(350nm, 하단)(N = 3 샘플 복제, 평균 및 표준 편차도 표시됨).스케일 바 = 10 μm.한 이미지의 스케일 바는 한 패널에 있는 모든 이미지의 스케일을 나타냅니다.원시 데이터는 원시 데이터 파일 형식으로 제공됩니다.
αS/pLK 정전기 복합체 응축에 대한 관찰과 tau31과의 직접적인 상호 작용을 통해 tau/RNA 응축물의 클라이언트 분자로서 αS에 대한 이전 관찰을 바탕으로 우리는 αS와 tau가 RNA가 없는 경우 용매와 함께 분리될 수 있다는 가설을 세웠습니다. 응축.αS는 αS/Tau 코아세르베이트의 골격 단백질입니다(그림 2e의 타우 전하 분포 참조).우리는 10μM αS와 10μM Tau441(각각 1μM AF488-αS 및 1μM Atto647N-Tau 포함)을 LLPS 완충액에서 함께 혼합하면 WF 현미경으로 볼 수 있듯이 두 단백질을 모두 포함하는 단백질 응집체가 쉽게 형성된다는 것을 관찰했습니다.(그림 2a).액적에서 두 단백질의 공동 위치화는 공초점(CF) 현미경으로 확인되었습니다(보충 그림 1a).dextran-70을 응집제로 사용한 경우에도 비슷한 행동이 관찰되었습니다 (보충 그림 1c).FITC 라벨이 붙은 PEG 또는 dextran을 사용하여 두 크라우딩 에이전트가 샘플 전체에 고르게 분포되어 분리나 연관성을 나타내지 않음을 발견했습니다(보충 그림 1d).오히려, 이 시스템에서는 다른 LLP 시스템에서 볼 수 있듯이 PEG가 우선적으로 안정적인 크라우딩제이기 때문에 거대분자 크라우딩 효과를 통해 상 분리를 촉진한다고 제안합니다.이 단백질이 풍부한 액적은 NaCl(1M)에는 민감했지만 1,6-HD(10% v/v)에는 민감하지 않아 정전기적 특성을 확인했습니다(보충 그림 2a, b).BF 현미경을 사용하여 밀리초 단위로 병합되는 액적 이벤트를 관찰하여 유체 거동을 확인했습니다(그림 2b).
LLPS 완충액(각 단백질 10μM, AF488로 표지된 αS 및 Atto647N으로 표지된 Tau441)에서 αS/Tau441 코아세르베이트의 공초점(CF) 현미경 이미지.b αS/Tau441 액적 융합 이벤트의 대표적인 미분 간섭 대비(DIC) 이미지(각 단백질에 대해 10μM).c 50μM αS가 없거나(왼쪽) 있거나 존재하는 경우(오른쪽) Tau441 LLPS(0-15μM)의 광 산란(350nm)을 기반으로 한 위상 다이어그램.따뜻한 색상은 더 많은 산란을 나타냅니다.d αS 농도가 증가하는 αS/Tau441 LLPS 샘플의 광 산란(5μM의 Tau441, 표시된 대로 N = 2-3 샘플 반복).e 본 연구에 사용된 일부 타우 단백질 변이체와 단백질의 다양한 영역에 대한 도식적 표현: 음전하를 띤 N-말단 도메인(빨간색), 프롤린이 풍부한 영역(파란색), 미세소관 결합 도메인(MTBD, 주황색으로 강조 표시) 및 아밀로이드 형성 쌍 나선.MTBD(회색) 내에 위치한 필라멘트 영역(PHF).Tau441의 NCPR(순 잔류물당 전하량) 맵이 표시됩니다.f 1μM AF488 표시 αS 및 Atto647N 표시 ΔNt- 사용, ΔNt-Tau(상단, 단백질당 10μM) 또는 K18(하단, 단백질당 50μM) 존재 하에 1μM AF488 표시 αS 또는 ΔCt-αS 사용 ) ) ) LLPS 또는 K18 완충액에 응축된 WF의 현미경 사진.한 이미지의 스케일 막대는 한 패널에 있는 모든 이미지의 스케일을 나타냅니다(패널 a, b 및 f의 경우 20μm).패널 c와 d의 원시 데이터는 원시 데이터 파일로 제공됩니다.
이 LLPS 공정에서 αS의 역할을 테스트하기 위해 먼저 증가하는 농도의 NaCl을 사용하여 비탁법을 통해 αS가 액적 안정성에 미치는 영향을 조사했습니다(그림 2c).αS를 함유한 샘플의 염 농도가 높을수록 광 산란 값(350nm에서)이 높아지며, 이는 이 LLPS 시스템에서 αS의 안정화 역할을 나타냅니다.αS 농도(따라서 αS:Tau441 비율)를 대략적으로 증가시켜 유사한 효과를 관찰할 수 있습니다.타우 농도(5μM)에 비해 10배 증가합니다(그림 2d).αS가 코아세르베이트의 비계 단백질임을 입증하기 위해 우리는 ΔNt-Tau라고 불리는 음으로 하전된 N 말단 영역(잔류물 1-150, 그림 2e 참조)이 없는 LLPS 파괴 Tau 돌연변이의 거동을 조사하기로 결정했습니다.WF 현미경 및 비탁법은 이전에 보고된 바와 같이 ΔNt-Tau 자체가 LLPS를 거치지 않았음을 확인했습니다(그림 2f 및 보충 그림 2d). 그러나 αS가 잘린 Tau 변종의 분산 용액에 추가되면 LLPS 공정이 완전히 유사한 조건 및 단백질 농도에서 Tau 및 αS의 전체 크기 용액의 액적 밀도에 가까운 액적 밀도로 복원되었습니다.이 과정은 낮은 거대 분자 밀집 조건에서도 관찰 될 수 있습니다 (보충 그림 2c).LLPS 공정에서 전체 길이가 아닌 C 말단 αS 영역의 역할은 (ΔCt- αS) 단백질 (그림 2f 및 보충 그림 2d).αS와 ΔNt-Tau의 공동 국소화는 공초점 형광 현미경으로 확인되었습니다(보충 그림 1b).
Tau441과 αS 사이의 LLPS 메커니즘을 추가로 테스트하기 위해 추가 Tau 변형, 즉 미세소관 결합 도메인(MTBD)의 한 쌍의 나선형 필라멘트 코어(PHF) 단편이 사용되었습니다. 이는 일반적으로 알려진 4개의 특징적인 반복 도메인을 포함하는 경우 K18 단편으로 (그림 2e 참조).최근 αS는 미세소관 결합 도메인보다 앞선 순서로 프롤린이 풍부한 도메인에 위치한 타우 단백질에 우선적으로 결합하는 것으로 보고되었습니다.그러나 PHF 영역에는 양전하를 띤 잔류물(그림 2e 참조), 특히 라이신(15% 잔류물)이 풍부하여 이 영역이 αS/Tau 복합체의 응축에도 기여하는지 여부를 테스트하게 되었습니다.우리는 테스트된 조건(15% PEG 또는 20% 덱스트란을 포함하는 LLPS 완충액)에서 K18만으로는 최대 100μM 농도에서 LLPS를 유발할 수 없음을 관찰했습니다(그림 2f).그러나 50 μM K18에 50 μM αS를 첨가하면 비탁법(보충 그림 2d)과 WF 현미경(그림 2f)을 통해 K18과 αS를 포함하는 단백질 액적의 빠른 형성이 관찰되었습니다.예상대로 ΔCt-αS는 K18의 LLPS 동작을 복원하지 못했습니다(그림 2f).αS/K18 응집은 αS/ΔNt-Tau 또는 αS/Tau441에 비해 LLPS를 유도하기 위해 약간 더 높은 단백질 농도가 필요하며 다른 사항은 동일합니다.이는 이전에 설명한 대로 미세소관 결합 도메인에 비해 프롤린이 풍부한 타우 도메인과 αS C 말단 영역의 더 강한 상호 작용과 일치합니다(31).
ΔNt-Tau는 αS가 없을 때 LLPS를 수행할 수 없다는 점을 고려하여 전체 길이 Tau(isotype, Tau441/Tau441)가 있는 LLPS 시스템의 단순성을 고려하여 αS/Tau LLPS를 특성화하기 위한 모델로 이 Tau 변형을 선택했습니다.복잡한(이종형, αS/Tau441) 응집 프로세스를 사용합니다.우리는 원심분리 및 분산상 SDS-PAGE 분석(2e 참조)을 통해 αS/Tau 및 αS/ΔNt-Tau 시스템에서 αS 응집 정도(축합상 단백질 fαS,c의 일부)를 비교했으며 매우 유사한 값을 발견했습니다. ​​동일한 농도의 모든 단백질에 대해.특히, αS/Tau 및 αS/ΔNt-Tau에 대해 각각 fαS,c 84 ± 2% 및 79 ± 7%를 얻었으며, 이는 αS와 타우 사이의 이형 상호작용이 타우 분자 사이의 상호작용보다 우수함을 시사합니다.사이.
다양한 폴리양이온과의 상호작용과 축합 과정이 αS 동역학에 미치는 영향은 광표백 후 형광 회복(FRAP) 방법을 통해 처음으로 연구되었습니다.우리는 αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau 및 αS/pLK 코아세르베이트(2μM αS AF488-αS 및 100μM Tau441 또는 ΔNt-Tau 또는 1mM pLK가 보충된 100μM αS)를 테스트했습니다.샘플 성분을 혼합한 후 처음 30분 이내에 데이터를 얻었습니다.대표적인 FRAP 이미지(그림 3a, αS/Tau441 응축)와 해당 시간 경과 곡선(그림 3b, 보충 그림 3)에서 αS 동역학이 Tau441 코아세르베이트의 동역학과 매우 유사하다는 것을 알 수 있습니다.그리고 pLK를 사용하면 훨씬 빠른 ΔNt-Tau가 있습니다.FRAP(Kang et al. 35에 의해 설명됨)에 따라 코아세르베이트 내부의 αS에 대해 계산된 확산 계수는 αS/Tau441 및 αS/ΔNt의 경우 D = 0.013 ± 0.009 μm2/s 및 D = 0.026 ± 0.008 μm2/s입니다. αS/ 시스템.pLK, Tau 및 D = 각각 0.18 ± 0.04 µm2/s입니다(그림 3c).그러나 분산상의 확산 계수 αS는 동일한 조건(LLPS 버퍼)에서 형광 상관 분광법(FCS, 보충 그림 3 참조)에 의해 결정된 모든 응축상보다 몇 배 더 높지만 폴리양이온이 없는 경우 (D = 8 ± 4 µm2/s).따라서 모든 코아세르베이트는 타우 단계와 달리 형성 후 처음 30분 동안 액체와 같은 특성을 유지하지만 뚜렷한 분자 밀집 효과로 인해 분산상의 단백질에 비해 코아세르베이트에서 αS 번역의 동역학이 크게 감소합니다.pLK 응축수의 동역학이 더 빠릅니다.
a-c 정전기 코아세르베이트에서 αS 역학(2% AF488로 표지된 αS)의 FRAP 분석.αS/Tau441 FRAP 분석의 대표 이미지는 3중으로 표시되며, 여기서 빨간색 원은 탈색된 영역을 나타냅니다.스케일 바는 5μm입니다.b 평균 FRAP 곡선 및 (c) 100 μM αS 및 등몰 농도의 Tau441(빨간색) 또는 ΔNt-Tau(파란색) 또는 pLK(녹색)를 사용한 3가지 실험에서 5-6(N)개의 서로 다른 액적에 대해 계산된 확산 계수(D) LLPS 농도의 10배입니다.FRAP 곡선의 ​​표준 편차는 음영 처리된 색상으로 표시됩니다.비교를 위해 분산상의 확산 계수 αS는 형광 상관 분광법(FCS)을 사용하여 3중으로 결정되었습니다(자세한 내용은 보충 그림 3 및 방법 참조).d 폴리양이온(검정색)이 없거나 100μM Tau441(빨간색) 또는 ΔNt-Tau(파란색) 또는 1mM pLK(녹색)가 있는 LLPS 완충액에서 100μM TEMPOL-122-αS의 연속 X-밴드 EPR 스펙트럼.삽입된 그림은 가장 극적인 변화가 일어나는 강한 자력선을 확대한 모습을 보여줍니다.e LLPS가 없는 경우(PEG 없음) 다양한 폴리양이온을 사용한 50μM TEMPOL-122-αS의 결합 곡선.정규화된 EPR 스펙트럼의 밴드 II(IIII/III)에 비해 밴드 III의 감소된 진폭은 Tau441(빨간색), ΔNt-Tau(파란색) 및 pLK(녹색)의 몰 비율을 증가시키는 것으로 나타났습니다.컬러 라인은 각 곡선에 n개의 동일하고 독립적인 결합 사이트가 있는 대략적인 결합 모델을 사용하여 데이터에 대한 적합성을 보여줍니다.원시 데이터는 원시 데이터 파일 형식으로 제공됩니다.
보완책으로 우리는 지향성 스핀 라벨링(SDSL)과 연속 전자 상자성 공명(CW-EPR)을 사용하여 다양한 코아세르베이트에서 αS의 역학을 조사했습니다.이 방법은 현실적인 잔여 해상도36,37,38로 IDP의 유연성과 역동성을 보고하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다.이를 위해 우리는 단일 Cys 돌연변이에서 시스테인 잔기를 구축하고 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) 스핀 프로브를 사용했습니다.말레이미드 유도체가 라벨을 붙입니다.보다 구체적으로, 우리는 위치 122 또는 24 αS(TEMPOL-122-αS 및 TEMPOL-24-αS)에 TEMPOL 프로브를 삽입했습니다.첫 번째 경우, 우리는 폴리양이온과의 상호작용에 관여하는 단백질의 C-말단 영역을 표적으로 삼습니다.대신, 위치 24는 응축물에 있는 단백질의 전반적인 역학에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.두 경우 모두 분산상의 단백질에 대해 얻은 EPR 신호는 빠르게 움직이는 상태의 질산화물 라디칼에 해당합니다.tau 또는 pLK(1:1 비율의 100 μM TEMPOL-αS, Tau441 또는 ΔNt-Tau 또는 1:10 비율의 pLK) 존재 하에서 상 분리 후 상대 피크 강도의 증가가 관찰되었습니다. αS의 EPR 스펙트럼.손실 선이 넓어져 희석 단계의 단백질과 비교하여 액적의 αS 재배향 동역학이 감소했음을 나타냅니다(그림 3d, 보충 그림 4a).이러한 변화는 위치 122에서 더 두드러집니다. 위치 24에서 pLK의 존재는 프로브의 동역학에 영향을 미치지 않았지만 위치 122에서는 스펙트럼 선 모양이 크게 변경되었습니다 (보조 그림 4a).스핀 표지된 IDP38,39의 역학을 설명하는 데 일반적으로 사용되는 등방성 모델(보충 그림 5a)을 사용하여 두 개의 αS/폴리양이온 시스템의 위치 122에서 스펙트럼을 모델링하려고 시도했을 때 실험 스펙트럼을 재구성할 수 없었습니다..24 스핀 대비 위치의 스펙트럼 시뮬레이션 (보충 그림 5a).이는 다중양이온이 있을 때 αS의 C-말단 영역의 스핀 구성 공간에 우선적인 위치가 있음을 시사합니다.실험적 EPR 조건(αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau 및 αS/pLK에 대해 각각 84 ± 2%, 79 ± 7% 및 47 ± 4%)에서 응축상의 αS 분율을 고려할 때 보충 참조 데이터 분석 c)의 그림 2e에서, EPR 방법에 의해 검출된 확장은 주로 αS의 C-말단 영역과 축합상의 다양한 폴리양이온의 상호작용을 반영한다는 것을 알 수 있습니다(TEMPOL-122-122를 사용할 때의 주요 변화). αS), 단백질 응축이 아닙니다.프로브에서 미세점도의 증가가 관찰됩니다.예상대로 LLPS 이외의 조건에서 단백질의 EPR 스펙트럼은 1M NaCl을 혼합물에 첨가하면 완전히 복원되었습니다 (보충 그림 4b).전반적으로, 우리의 데이터는 CW-EPR에 의해 감지된 변화가 주로 αS의 C-말단 영역과 응축상의 다양한 폴리양이온의 상호작용을 반영한다는 것을 시사하며, 이러한 상호작용은 Tau보다 pLK에서 더 강한 것으로 보입니다.
코아세르베이트의 단백질에 대한 더 많은 구조적 정보를 얻기 위해 우리는 용액에서 NMR을 사용하여 LLPS 시스템을 연구하기로 결정했습니다.그러나 우리는 분산상에 남아 있는 αS 분획만 검출할 수 있었는데, 이는 NMR 분석에서 코아세르베이트 내부의 단백질 역학 감소와 용액 바닥의 조밀한 상 때문일 수 있습니다.NMR을 사용하여 LLPS 샘플의 분산상에 남아 있는 단백질의 구조와 역학을 분석했을 때(보충 그림 5c, d), pLK와 ΔNt-Tau가 있는 경우 단백질이 거의 동일하게 거동하는 것을 확인했습니다. 이는 2차 화학적 이동과 R1ρ 이완에 대한 실험을 통해 밝혀진 단백질 백본의 2차 구조와 역학에 있었습니다.NMR 데이터에 따르면 αS의 C 말단은 폴리양이온과의 상호작용으로 인해 단백질 서열의 나머지 부분과 마찬가지로 무질서한 특성을 유지하면서 구조적 유연성이 크게 손실되는 것으로 나타났습니다.
TEMPOL-122-αS 응축상에서 관찰된 CW-EPR 신호 확장은 단백질과 다중양이온의 상호작용을 반영하기 때문에 우리는 LLPS가 없는 경우(축적 없음) 다양한 다중양이온에 대한 αS의 결합 친화도를 평가하기 위해 EPR 적정을 수행했습니다. 버퍼 LLPS), 이는 상호 작용이 희석 및 농축 단계에서 동일함을 나타냅니다(이는 데이터, 보충 그림 4a 및 보충 그림 6에 의해 확인됨).목표는 모든 코아세르베이트가 일반적인 유체와 같은 특성에도 불구하고 분자 수준에서 근본적인 차별적 행동을 나타내는지 확인하는 것이었습니다.예상대로 EPR 스펙트럼은 폴리 양이온 농도가 증가함에 따라 넓어졌으며 모든 상호 작용 파트너의 분자 상호 작용으로 인한 분자 유연성 감소가 거의 포화 상태에 이르렀음을 반영합니다 (그림 3e, 보충 그림 6).pLK는 ΔNt-Tau 및 Tau441에 비해 더 낮은 몰비(다가양이온:αS)에서 이러한 포화도를 달성했습니다.실제로, n개의 동일하고 독립적인 결합 부위를 가정하는 대략적인 결합 모델과 데이터를 비교하면 pLK의 겉보기 해리 상수(~5μM)가 Tau441 또는 ΔNt-Tau(~50μM)보다 한 자릿수 낮은 것으로 나타났습니다. ).μM).이는 대략적인 추정치이지만 이는 αS가 연속적인 양전하 영역을 갖는 단순한 다중양이온에 대해 더 높은 친화력을 가지고 있음을 시사합니다.αS와 다양한 폴리양이온 간의 친화력 차이를 고려할 때, 우리는 이들의 액체 특성이 시간이 지남에 따라 다르게 변하여 서로 다른 LSPT 프로세스로 인해 어려움을 겪을 수 있다는 가설을 세웠습니다.
단백질 코아세르베이트 내의 매우 혼잡한 환경과 단백질의 아밀로이드 특성을 고려하여 우리는 가능한 LSPT 프로세스를 감지하기 위해 시간이 지남에 따라 코아세르베이트의 동작을 관찰했습니다.BF 및 CF 현미경(그림 4)을 사용하여 αS/Tau441이 용액에서 상당 부분 코아세르베이션하여 예상대로 웰/슬라이드 바닥의 표면과 접촉하고 적시는 큰 액적을 전체 액적으로 형성하는 것을 관찰했습니다(보충 그림 .7d);우리는 이러한 바닥 형태의 구조를 "단백질 뗏목"이라고 부릅니다.이러한 구조는 융합 능력을 유지하면서 유동적으로 유지되었으며(보조 그림 7b) LLPS가 트리거된 후 몇 시간 동안 볼 수 있었습니다(그림 4 및 보충 그림 7c).우리는 불균형 전하와 높은 정전기 표면 전위를 갖는 정전 코아세르베이트에 대해 예상되는 것처럼 소수성 물질보다는 친수성 물질의 표면에서 습윤 과정이 선호된다는 것을 관찰했습니다 (보조 그림 7a).특히 αS/ΔNt-Tau 유착 및 래프팅은 크게 감소한 반면 αS/pLK 응축물은 크게 감소했습니다(그림 4).짧은 인큐베이션 시간 동안 αS/pLK 액적은 친수성 표면을 합쳐서 젖게 할 수 있었지만 이 과정은 빠르게 중단되었으며 5시간의 인큐베이션 후에는 제한된 유착 현상만 관찰되었으며 젖음 현상은 관찰되지 않았습니다.– 젤-드립 전환.
100μM Tau441(상단) 형광이 있는 상태에서 LLPS 완충액에 100μM αS(1% 형광 라벨)를 함유한 코아세르베이트 샘플의 대표적인 BF(회색조 패널) 및 CF(오른쪽 패널, 녹색의 AF488 표시 αS) 현미경 이미지 ΔNt -다양한 배양 시간과 초점 높이(z, 플레이트 웰 바닥으로부터의 거리)에서 Tau(중앙) 또는 1mM pLK(하단).실험은 서로 독립적으로 4~6회 반복되었으며 동일한 결과가 나왔습니다.αS/Tau441 코아세르베이트는 24시간 후에 젖어 이미지보다 큰 뗏목을 형성합니다.모든 이미지의 스케일 바는 20μm입니다.
그런 다음 우리는 αS/Tau441 LLPS에 형성된 대규모 유체형 단백질 풀이 연구된 단백질의 아밀로이드 응집으로 이어질지 여부를 물었습니다.우리는 위와 동일한 조건에서 WF 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 αS/Tau441 액적의 성숙을 추적했지만 1μM AF488로 표지된 αS와 Atto647N으로 표지된 Tau441을 사용했습니다(그림 5a).예상대로 우리는 성숙 과정 전반에 걸쳐 완전한 단백질 위치를 관찰했습니다.흥미롭게도 ca.5시간 후, "포인트"라고 불리는 뗏목 내부에서 더 강렬한 비원형 구조가 관찰되었으며, 그 중 일부는 αS와 동일 위치에 있었고 일부는 Tau441이 풍부했습니다(그림 5a, 흰색 화살표).이러한 지점은 αS/ΔNt-Tau보다 αS/ΔNt-Tau에 대해 더 큰 정도로 뗏목 내에서 항상 관찰되었습니다.융합/습윤에 적합하지 않은 pLK 및 Tau 시스템의 액적에는 뚜렷한 지점이 없었습니다.αS 및 Tau441을 포함하는 이러한 얼룩이 아밀로이드 유사 응집체인지 여부를 테스트하기 위해 Tau441을 Atto647N으로 표지하고 처음부터 12.5 μM 아밀로이드 특이적 티오플라빈-T(ThT)를 첨가한 CF 현미경을 사용하여 유사한 실험을 수행했습니다.먹이다.αS/Tau441 액적 또는 뗏목의 ThT 염색은 24시간 배양 후에도 관찰되지 않았지만(그림 5b, 윗줄 - 단백질 뗏목 위에 남은 액적), 뗏목 내부에 Atto647N-Tau441을 포함하는 ThT 양성 구조는 매우 약했습니다.이는 이전에 설명한 반점(그림 5b, 중간 및 하단 행)의 크기, 모양 및 위치를 복제하며, 이는 반점이 노화 유체 코아세르베이트에서 형성된 아밀로이드 유사 응집체에 해당할 수 있음을 시사합니다.
LLPS 완충액이 포함된 현미경 플레이트의 웰에 25μM Tau441(1μM AF488 표시 αS 및 Atto647N 표시 Tau441) 존재 하에서 다양한 배양 시간 및 초점 높이(z, 결합되지 않은 바닥으로부터의 거리)에서 WF 25μM αS) .6개의 실험을 독립적으로 반복하여 유사한 결과를 얻었습니다.b 25μM Tau441(1μM Atto647N 표시 Tau441) 및 12.5μM 티오플라빈-T(ThT) 존재 하에서 25μM αS의 CF 현미경 이미지.가중 단백질 방울과 침전된 단백질 뗏목 및 반점이 각각 상단 및 중간 행에 표시됩니다.맨 아래 행에는 3개의 독립적인 복제물에서 얻은 뗏목 및 낙하 이미지가 표시됩니다.흰색 화살표는 두 패널 모두에서 ThT 양성 점을 나타냅니다.모든 이미지의 스케일 바는 20μm입니다.
액체에서 고체로 전환하는 동안 코아세르베이트 단백질 네트워크의 변화를 더 자세히 조사하기 위해 FLIM(형광 수명 이미징)과 FRET(Förster 공명 에너지 전달 현미경)을 사용했습니다(그림 6 및 보충 그림 8 및 9).우리는 층의 코아세르베이트 성숙이 더 응축되거나 고체와 같은 응집된 단백질 구조로 성숙하면 단백질과 이에 부착된 형광 프로브 사이의 접촉이 더 긴밀해지며 잠재적으로 단축된 프로브 수명(τ)에서 나타나는 소멸 효과를 생성한다는 가설을 세웠습니다. , 이전에 설명한대로 40.,41,42.또한 이중 표지 샘플(각각 FRET 기증자 및 수용체 염료인 AF488 및 Atto647N)의 경우 τ의 이러한 감소는 코아세르베이트 축합 및 LSPT 동안 FRET(E) 효율의 증가를 동반할 수도 있습니다.우리는 LLPS αS/Tau441 및 αS/ΔNt-Tau 샘플(1μM AF488 라벨링된 αS 및/또는 Atto647N 라벨링된 Tau441 또는 ΔNt-Tau를 포함하는 LLPS 완충액의 각 단백질 25μM)에서 시간이 지남에 따라 뗏목 및 스팟 형성을 모니터링했습니다.우리는 코아세르베이트가 성숙함에 따라 AF488 (τ488) 및 Atto647N (τ647N) 프로브의 형광 수명이 약간 감소한다는 일반적인 경향을 관찰했습니다 (그림 6 및 보충 그림 8c).흥미롭게도 이 변화는 뗏목 내의 도트에서 크게 향상되었으며(그림 6c), 이는 도트에서 추가 단백질 응축이 발생했음을 나타냅니다.이를 뒷받침하기 위해 24시간 동안 노화된 αS/ΔNt-Tau 액적에 대해 형광 수명에 큰 변화가 관찰되지 않았으며(보조 그림 8d), 액적 겔화는 얼룩과 구별되는 과정이며 상당한 분자 재구성을 동반하지 않음을 나타냅니다. 코아세르베이트 내에서.αS, 특히 αS/Tau441 시스템의 경우 도트의 크기와 내용이 다양하다는 점에 유의해야 합니다(보조 그림 8e).스폿 형광 수명의 감소는 특히 Tau441로 표지된 Atto647N(보충 그림 8a)의 경우 강도 증가와 αS/Tau441 및 αS/ΔNt-Tau 시스템 모두에 대한 더 높은 FRET 효율을 동반하여 LLPS 5시간의 추가 응축을 나타냅니다. 트리거 후 정전기 내부의 단백질이 응축되었습니다.αS/ΔNt-Tau와 비교하여 우리는 αS/Tau441 지점에서 더 낮은 τ647N과 다소 높은 τ488 값을 관찰했으며, 이는 더 낮고 더 불균일한 FRET 값을 동반했습니다.아마도 이는 αS/Tau441 시스템에서 Tau441 자체도 LLPS 및 응집을 겪을 수 있기 때문에 응집체에서 관찰되고 예상되는 αS 풍부도가 Tau에 ​​비해 더 이질적이며 종종 아화학량론적이라는 사실과 관련이 있을 수 있습니다(보충 그림 8e). .그러나 액적 유착, 뗏목 형성 및 중요한 액체형 코아세르베이트 내 단백질 응집의 정도는 Tau441과 αS가 모두 존재할 때 최대입니다.
LLPS 완충액에서 각 단백질(1μM AF488로 표지된 αS 및 1μM Atto647N으로 표지된 Tau441 또는 ΔNt-Tau)의 25μM에서 αS/Tau441 및 αS/ΔNt-Tau의 평생 형광 현미경(FLIM) 이미지.열은 다양한 성숙 시간(30분, 5시간, 24시간)에서 LLPS 샘플의 대표적인 이미지를 보여줍니다.빨간색 프레임은 αS/Tau441 스팟이 포함된 영역을 보여줍니다.수명은 색상 막대로 표시됩니다.모든 이미지에 대해 스케일 바 = 20 μm입니다.b 패널 a의 빨간색 상자에 표시된 선택 영역의 확대된 FLIM 이미지.수명 범위는 패널 a와 동일한 색상 척도를 사용하여 표시됩니다.스케일 바 = 5 μm.c αS-에 대해 기록된 FLIM 이미지에서 확인된 다양한 단백질 종(액적-D-, raft-R- 및 얼룩-P)에 대한 AF488(αS에 부착) 또는 Atto647N(Tau에 부착)을 보여주는 히스토그램 Tau441의 타이밍 분포 수명 및 αS/ΔNt-Tau 코아세르베이트 샘플(N = D의 경우 17-32 ROI, R의 경우 29-44 ROI, 포인트의 경우 21-51 ROI).평균값과 중앙값은 각각 상자 안에 노란색 사각형과 검은색 선으로 표시됩니다.상자의 하한과 상한은 각각 1분위수와 3분위수를 나타내며, 1.5배 사분위수 범위(IQR) 내의 최소값과 최대값은 수염으로 표시됩니다.특이치는 검은색 다이아몬드로 표시됩니다.분포 쌍 간의 통계적 유의성은 분산이 다르다는 가정 하에 2-표본 t-검정을 사용하여 결정되었습니다.양측 t-검정 p-값은 비교된 데이터의 각 쌍에 대해 별표로 표시됩니다(* p-값 ​​> 0.01, ** p-값 ​​> 0.001, *** p-값 ​​> 0.0001, **** p-값 > 0.00001), ns 무시할 수 있음을 나타냅니다(p-값 > 0.05).정확한 p 값은 보충 표 1에 나와 있으며 원본 데이터는 원시 데이터 파일로 표시됩니다.
얼룩/응집체의 아밀로이드 유사 특성을 추가로 입증하기 위해 염색되지 않은 코아세르베이트 샘플을 고농도의 (1M) NaCl로 24시간 동안 처리하여 단백질 코아세르베이트에서 응집체가 분리되었습니다.원자간력현미경(AFM)을 사용하여 분리된 응집체(즉, 응집체의 분산된 용액)를 관찰했을 때, 우리는 약 15 nm의 일정한 높이를 갖는 주로 구형 형태를 관찰했는데, 이는 다음과 유사하게 높은 염 농도 조건에서 결합하는 경향이 있습니다. 표면의 강한 소수성 효과로 인한 전형적인 아밀로이드 원섬유의 거동(원섬유의 높이는 일반적으로 ~10 nm임)(보충 그림 10a).흥미롭게도 표준 ThT 형광 분석에서 분리된 응집체를 ThT와 함께 배양했을 때 염료가 전형적인 αS 아밀로이드 원섬유와 함께 배양되었을 때 관찰된 것과 비교하여 ThT 형광 양자 수율의 극적인 증가가 관찰되었습니다(보충 그림 10b). 코아세르베이트 집합체에는 아밀로이드 유사 구조가 포함되어 있습니다..실제로, 응집체는 높은 염 농도에는 내성이 있었지만 전형적인 아밀로이드 원섬유와 같이 4M 염화 구아니딘(GdnHCl)에는 민감했습니다(보충 그림 10c).
다음으로 단일 분자 형광, 특정 형광 상관/상호 상관 분광법(FCS/FCCS) 및 2색 일치 검출 버스트 분석(TCCD)을 사용하여 응집체의 구성을 분석했습니다.이를 위해 우리는 αS 및 Tau441(둘 다 25μM)을 1μM AF488 표시 αS 및 1μM Atto647N 표시 Tau441과 함께 포함하는 100μl LLPS 샘플에서 24시간 배양 후 형성된 응집체를 분리했습니다.동일한 PEG가 없는 완충액과 1 M NaCl(코아세르베이트에서 응집체를 분리하는 데 사용되는 동일한 완충액)을 사용하여 생성된 분산된 응집체 용액을 단분자 상태로 희석하여 LLPS와 단백질 사이의 가능한 정전기 상호 작용을 방지합니다.단일 분자의 시간 궤적의 예는 그림 7a에서 볼 수 있습니다.FCCS/FCS 분석(상호 상관, CC 및 자기 상관, AC)은 αS와 타우를 포함하는 응집체가 샘플에 풍부하고(그림 7b, 왼쪽 패널의 CC 곡선 참조) 과량의 잔류 단량체 단백질이 희석 과정의 결과입니다(그림 7b, 왼쪽 패널의 AC 곡선 참조).단량체 단백질만 포함하는 샘플을 사용하여 동일한 용액 조건에서 수행된 대조 실험에서는 CC 곡선이 나타나지 않았으며 AC 곡선은 단일 성분 확산 모델(식 4)과 잘 들어맞았습니다. 여기서 단량체 단백질은 예상 확산 계수를 갖습니다(그림 7b). ), 오른쪽 패널).응집된 입자의 확산계수는 1 µm2/s 미만이고, 단량체 단백질의 확산계수는 약 1 µm2/s입니다.50~100μm/s;값은 유사한 용액 조건에서 별도로 초음파 처리된 αS 아밀로이드 원섬유 및 단량체 αS에 대해 이전에 발표된 값과 유사합니다.TCCD 폭발 분석(그림 7c, 상단 패널)을 사용하여 응집체를 분석한 결과, 각 분리된 응집체(αS/Tau 이형 응집체)에서 감지된 응집체의 약 60%가 αS와 타우를 모두 포함하고 약 30%만 포함된 것으로 나타났습니다. 타우, 약 10% αS만.αS/Tau 이종 집합체의 화학양론적 분석은 이종 집합체의 대부분이 타우(0.5 미만, 집합체당 평균 타우 분자 수는 αS 분자보다 4배 더 많음)가 풍부한 것으로 나타났습니다. 이는 현장에서 FLIM에서 관찰된 우리의 작업과 일치합니다. 실험..FRET 분석은 실험에 사용된 표지되지 않은 단백질의 과잉으로 인해 각 응집체의 형광단 분포가 무작위적이었기 때문에 이 경우 실제 FRET 값은 그다지 중요하지 않지만 이러한 응집체에는 두 단백질이 모두 포함되어 있음을 보여주었습니다.흥미롭게도 45,46개의 성숙한 아밀로이드 응집이 결핍된 Tau 변종(보충 그림 11a, b 참조)을 사용하여 동일한 분석을 수행했을 때 αS 정전기 응집은 동일했지만(보충 그림 11c, d), 코아세르베이트 내에서 응집체를 형성하는 능력은 급격히 감소했으며 FLIM은 현장 실험에서 여러 지점을 감지했으며 분리된 응집체 샘플에 대해 약한 상호 상관 곡선이 관찰되었습니다.그러나 소수의 검출된 응집체(Tau441의 10분의 1)에 대해 우리는 각 응집체가 이 Tau 변형보다 αS가 풍부하다는 것을 관찰했으며 검출된 응집체의 약 50%는 αS 분자만 포함하고 αS는 과도하게 이질적이었습니다. .Tau441에 의해 생성된 이종 집합체(그림 6f)와는 대조적으로 집합체(보충 그림 11e 참조).이 실험의 결과는 αS 자체가 코아세르베이트 내에서 타우와 함께 축적될 수 있지만 이러한 조건에서 타우 핵 생성이 더 유리하며 생성된 아밀로이드 유사 응집체가 αS와 타우의 형태로 작용할 수 있음을 보여주었습니다.그러나 일단 타우가 풍부한 코어가 형성되면 αS와 타우 사이의 이형 상호작용은 타우 분자 사이의 동형 상호작용보다 집합체에서 선호됩니다.우리는 또한 액체 αS/타우 코아세르베이트의 단백질 네트워크를 관찰합니다.
αS/Tau441 정전기 코아세르베이트에서 형성된 분리된 응집체의 단일 분자의 대표적인 형광 시간적 흔적.αS/Tau441 응집체에 해당하는 버스트(표시된 임계값 이상의 버스트)는 3개의 검출 채널(직접 여기 후 AF488 및 Atto647N 방출, 파란색 및 빨간색 선, 간접 여기 후 Atto647N 방출), FRET, 보라색 선)에서 관찰되었습니다.b LLPS에서 얻은 분리된 αS/Tau441 응집체 샘플의 FCS/FCCS 분석(왼쪽 패널).AF488 및 Atto647N에 대한 자기상관(AC) 곡선은 각각 파란색과 빨간색으로 표시되고, 두 염료를 모두 포함하는 집합체와 관련된 상호상관(CC) 곡선은 보라색으로 표시됩니다.AC 곡선은 표지된 단량체 및 응집된 단백질 종의 존재를 반영하는 반면, CC 곡선은 이중 표지된 응집체의 확산만을 보여줍니다.동일한 분석이지만 격리된 지점과 동일한 용액 조건에서 단량체 αS 및 Tau441만 포함하는 샘플이 오른쪽 패널에 컨트롤로 표시됩니다.c αS/Tau441 정전기 코아세르베이트에서 형성된 분리된 응집체의 단일 분자에 대한 형광 플래시 분석.4개의 서로 다른 반복(N = 152)에서 발견된 각 집합체에 대한 정보는 화학량론, S 값 및 FRET 효율성(상단 패널, 색상 막대가 발생을 반영함)에 대해 표시됩니다.세 가지 유형의 응집체를 구별할 수 있습니다: S~1 및 FRET~0이 있는 -αS 전용 응집체, S~0 및 FRET~1이 있는 Tau 전용 응집체, 중간 S 및 FRET가 있는 이종 Tau/αS 응집체 양 추정 각 이질적 응집체(N = 100)에서 검출된 두 마커 단백질 중 하나가 하단 패널에 표시됩니다(색상 스케일은 발생을 반영함).원시 데이터는 원시 데이터 파일 형식으로 제공됩니다.
시간이 지남에 따라 액체 단백질 응축물이 겔상 또는 고체 구조로 성숙 또는 노화되는 것은 아밀로이드 응집에 앞서는 비정상적인 과정으로 질병뿐만 아니라 응축물의 여러 생리적 기능에 관여하는 것으로 보고되고 있다7,48,49. 우리는 상분리와 거동을 자세히 연구합니다.LPS의 일반적인 열역학적 구동 동작에 따라 낮은 마이크로몰 농도 및 생리학적 관련 조건(αS의 계산된 생리학적 농도는 >1 μM50임)의 통제된 환경에서 무작위 폴리양이온이 존재하는 LSPT αS.우리는 생리적 pH에서 매우 음으로 하전된 C 말단 영역을 포함하는 αS가 정전기 과정을 통해 pLK 또는 Tau와 같은 고도로 양이온성 무질서한 펩타이드가 있는 경우 LLPS를 통해 수용액에서 단백질이 풍부한 액적을 형성할 수 있음을 발견했습니다. 응집 거대분자의 존재 하에서의 복합 축합.이 과정은 αS가 시험관 내 및 생체 내에서 질병 관련 응집과 관련된 다양한 다가양이온 분자를 만나는 세포 환경에서 관련 효과를 가질 수 있습니다.
많은 연구에서 액적 내의 단백질 역학은 성숙 과정을 결정하는 핵심 요소 중 하나로 간주되었습니다.다중양이온이 있는 정전기적 αS 코아세르베이트에서 성숙 과정은 분명히 다중양이온과의 상호작용 강도, 원자가 및 이러한 상호작용의 다양성에 따라 달라집니다.평형 이론은 두 액체 상태의 평형 환경이 LLPS를 유도하는 생체고분자가 풍부한 큰 방울의 존재일 것이라고 제안합니다.액적 성장은 Ostwald 성숙59, 유착60 또는 분산상61에서 자유 단량체 소비에 의해 달성될 수 있습니다.αS 및 Tau441, ΔNt-Tau 또는 pLK의 경우 대부분의 단백질이 본 연구에서 사용된 조건 하에서 응축물에 농축되었습니다.그러나 전체 크기의 타우 액적은 표면 습윤 시 빠르게 합쳐졌지만 ΔNt-Tau 및 pLK의 경우 액적 유착 및 습윤이 어려웠으며 이는 이 두 시스템에서 액체 특성의 급속한 손실을 시사합니다.FLIM-FRET 분석에 따르면, 노화된 pLK와 ΔNt-Tau 액적은 원래 액적과 유사한 정도의 단백질 응집(유사한 형광 수명)을 나타냈는데, 이는 원래의 단백질 네트워크가 더 단단하기는 하지만 유지되었음을 시사합니다.
우리는 다음 모델에서 실험 결과를 합리화합니다(그림 8).초기에 일시적으로 형성된 액적은 종종 정전기 보상이 없는 단백질 네트워크이므로 특히 액적 경계면에 전하 불균형 영역이 있어 정전기 표면 전위가 높은 액적이 생성됩니다.전하(일반적으로 원자가 고갈이라고 하는 현상)를 보상하고 액적의 표면 전위를 최소화하기 위해 액적은 희석 단계의 새로운 폴리펩티드를 포함하고 단백질 네트워크를 재구성하여 전하-전하 상호 작용을 최적화하고 다른 액적과 상호 작용할 수 있습니다.표면(습윤).αS/pLK 액적은 더 단순한 단백질 네트워크(αS와 pLK 사이의 이형 상호작용만)와 단백질-단백질 상호작용에 대한 더 큰 친화력으로 인해 응축물의 전하 균형을 더 빨리 맞출 수 있는 것으로 보입니다.실제로 우리는 αS/Tau보다 초기에 형성된 αS/pLK 코아세르베이트에서 더 빠른 단백질 동역학을 관찰했습니다.원자가가 고갈된 후에는 상호 작용의 일시적인 현상이 줄어들고 액적은 액체 특성을 잃고 정전기 표면 전위가 낮은 젤 같은 불연성 액적으로 변합니다(따라서 표면을 적실 수 없음).대조적으로, αS/Tau 액적은 더 복잡한 단백질 네트워크(동형 및 이형 상호작용 모두 포함)와 단백질 상호작용의 약한 특성으로 인해 액적 전하 균형을 최적화하는 데 덜 효율적입니다.이로 인해 장기간 액체 거동을 유지하고 응집 및 성장(따라서 액적의 표면적/부피 비율 최소화) 및 친수성 표면 화학을 적심으로써 최소화되는 경향이 있는 높은 정전기 표면 전위를 나타내는 액적이 생성됩니다.이는 단백질 네트워크의 전하 최적화에 대한 지속적인 검색으로 인해 상호 작용이 매우 일시적으로 유지되므로 유체 특성을 유지하는 대규모 농축 단백질 라이브러리를 생성합니다.흥미롭게도 자연적으로 발생하는 일부 isoform을 포함하여 N 말단이 잘린 형태의 Tau는 중간 거동을 나타내며 일부 코아세르베이트는 αS와 함께 노화되어 수명이 긴 젤 같은 물방울로 바뀌고 다른 일부는 큰 액체 응축물로 변환됩니다.αS 정전 코아세르베이트 성숙의 이러한 이중성은 응축수 크기 및 유체 특성을 제어하는 ​​핵심으로 응축수의 원자가 고갈과 정전기 체질 사이의 상관관계를 확인한 최근 LLPS 이론 및 실험 연구와 일치합니다.메커니즘 58.61.
이 계획은 LLPS 및 LSPT를 통한 αS 및 Tau441에 대한 추정 아밀로이드 응집 경로를 보여줍니다.추가 음이온이 풍부한(빨간색) 및 양이온이 풍부한(파란색) 영역을 사용하면 만족스러운 원자가를 갖는 αS 및 타우 정전 코아세르베이트는 표면 에너지가 낮으므로 유착이 적어 액적 노화가 빨라집니다.안정적인 비응집 겔 상태가 달성됩니다..이러한 상황은 αS/pLK 시스템의 경우 더 높은 친화력과 더 간단한 단백질 쌍 상호 작용 네트워크로 인해 매우 유리하며, 이로 인해 빠른 젤과 같은 전환이 가능해집니다.반대로, 불만족스러운 원자가를 갖는 액적 및 이에 따른 상호작용에 이용 가능한 단백질 전하 영역은 코아세르베이트가 높은 표면 에너지를 감소시키기 위해 친수성 표면을 융합하고 적시는 것을 더 쉽게 만듭니다.이러한 상황은 약한 Tau-Tau 및 αS-Tau 상호작용으로 구성된 다가 복합 네트워크를 갖는 αS/Tau441 코아세르베이트에 바람직합니다.결과적으로, 더 큰 코아세르베이트는 유체와 같은 특성을 더 쉽게 유지하여 다른 단백질 간 상호 작용이 발생할 수 있습니다.결국 αS와 타우를 모두 포함하는 아밀로이드 이종 응집체는 코아세르베이트 유체 내에서 형성되며, 이는 신경퇴행성 질환의 특징인 봉입체에서 발견되는 것과 관련이 있을 수 있습니다.
매우 혼잡하지만 역동적인 단백질 환경에서 αS/Tau441이 성숙하는 동안 형성된 대형 유체 유사 구조와 αS/ΔNt-Tau 코아세르베이트는 단백질 응집의 핵 생성을 위한 이상적인 저장소입니다.우리는 실제로 αS와 타우를 모두 포함하는 이러한 유형의 단백질 코아세르베이트에서 고체 단백질 응집체가 형성되는 것을 관찰했습니다.우리는 이러한 이종응집체가 비전기적 상호작용에 의해 안정화되고, 전형적인 아밀로이드 원섬유와 동일한 방식으로 아밀로이드 특이적 ThT 염료에 결합할 수 있으며, 실제로 다양한 영향에 대해 유사한 저항성을 갖는다는 것을 보여주었습니다.LLPS에 의해 형성된 αS/tau 응집체는 아밀로이드와 유사한 특성을 갖는 것으로 나타났습니다.실제로, 아밀로이드 응집이 결핍된 Tau의 성숙한 변이체는 액체 정전기 코아세르베이트 내에서 이러한 이질적인 αS 응집체의 형성에 크게 손상됩니다.αS/Tau441 집합체의 형성은 액체와 같은 특성을 유지하는 코아세르베이트 내부에서만 관찰되었으며, 코아세르베이트/액적이 겔 상태에 도달하지 않은 경우에는 결코 관찰되지 않았습니다.후자의 경우, 정전기적 상호작용의 강도가 증가하고 결과적으로 단백질 네트워크의 강성이 증가하여 아밀로이드 핵형성에 필요한 새로운 단백질 상호작용을 확립하기 위해 필요한 단백질의 구조적 재배열을 방지합니다.그러나 이는 보다 유연한 액체형 코아세르베이트에서 달성될 수 있으며, 이는 크기가 증가함에 따라 액체 상태를 유지할 가능성이 더 높습니다.
응축된 상 내 응집체 형성이 빠르게 겔화되는 작은 액적보다 큰 αS/Tau 응축물에서 더 바람직하다는 사실은 액적 유착을 제어하는 ​​요인을 식별하는 것과의 관련성을 강조합니다.따라서 상분리 경향이 있을 뿐만 아니라, 질병 예방뿐만 아니라 적절한 기능을 위해서는 응축액의 크기도 조절되어야 한다58,61.우리의 결과는 또한 αS/Tau 시스템에 대한 LLPS와 LSPT 간의 균형의 중요성을 강조합니다.액적 형성은 다른 시스템에서 제안된 것처럼 포화 조건에서 이용 가능한 단백질 단량체의 양을 줄임으로써 아밀로이드 응집을 방지할 수 있지만63,64 높은 액적 수준에서의 액적 융합은 느린 구조적 재배열을 통해 내부 단백질 응집으로 이어질 수 있습니다.단백질 네트워크..
전반적으로, 우리의 데이터는 LSPT의 맥락에서 드롭 네트워크의 응집력 원자가 및 만족/불만족 상호 작용의 관련성을 강력히 강조합니다.특히, 우리는 전장 αS/Tau441 응축물이 효율적으로 융합하고 핵생성하여 두 단백질을 모두 포함하는 아밀로이드 유사 이종응집체를 형성하고 실험 결과를 기반으로 분자 메커니즘을 제안할 수 있음을 보여줍니다.우리가 여기서 보고하는 αS/Tau 유체 코아세르베이트에서 두 단백질의 공동 응집은 실제로 질병의 특징인 포함 내 두 단백질의 공동 위치화와 관련이 있을 수 있으며 LLPS와 사이의 관계를 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 아밀로이드 응집은 신경퇴행에서 고도로 전하된 IDP의 길을 열어줍니다.
단량체성 WT-αS, 시스테인 돌연변이체(Q24C-αS, N122C-αS) 및 ΔCt-αS 변종(Δ101-140)을 E. coli에서 발현시키고 이전에 설명한 바와 같이 정제하였다.이황화 결합 형성을 방지하기 위해 αS 시스테인 돌연변이체 정제의 모든 단계에 5mM DTT를 포함시켰습니다.Tau441 isoform(Addgene #16316에서 얻은 플라스미드), ΔNt-Tau 변이체(Δ1-150, 프라이머 CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC로 IVA를 클로닝하여 얻은) 및 AggDef-Tau 변이체(Δ275-311, GGCTC5 프라이머로 정제) 대장균 배양물은 37°C, 180rpm에서 OD600 = 0.6~0.7로 성장했고, 발현은 37°C에서 3시간 동안 IPTG로 유도되었습니다.4°C에서 15분 동안 11,500 xg에서 세포를 수확하고 150 mM NaCl을 함유한 식염수 완충액으로 세척합니다.용해 완충액(1L LB당 20ml: MES 20mM, pH 6.8, NaCl 500mM, EDTA 1mM, MgCl2 0.2mM, DTT 5mM, PMSF 1mM, 벤즈아미딘 50μM, 코펩틴 100μM)에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.초음파 처리 단계는 10 펄스(1분 켜짐, 1분 꺼짐) 동안 80% 진폭으로 얼음 위에서 수행되었습니다.한 번의 초음파 검사에서 60ml를 초과하지 마십시오.E. coli 용해물을 95℃에서 20분 동안 가열한 다음, 얼음 위에서 냉각하고 127,000 xg에서 40분 동안 원심분리했습니다.정화된 상청액을 3.5 kDa 막(Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK)에 적용하고 4 L의 투석 완충액(20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM)에 대해 투석했습니다. , PMSF 0.1 mM)을 10시간 동안 유지하였다.5ml 양이온 교환 컬럼(HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA)을 평형 완충액(20mM MES, pH 6.8, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 2mM MgCl2, 2mM DTT, 0.1mM PMSF)으로 평형화했습니다.타우 용해물을 0.22μm PVDF 필터를 통해 여과하고 1ml/분의 유속으로 컬럼에 주입했습니다.용출은 점진적으로 수행되었으며, tau는 15-30% 용출 완충액(20mM MES, pH 6.8, 1M NaCl, 1mM EDTA, 2mM MgCl2, 2mM DTT, 0.1mM PMSF)으로 용출되었습니다.분획을 SDS-PAGE로 분석하고, 타우의 예상 분자량을 갖는 하나의 밴드를 포함하는 모든 분획을 10 kDa 원심분리기 필터를 사용하여 농축하고 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM 및 DTT 2 mM을 포함하는 완충액으로 교체했습니다. 최종 단백질 농도는 100 μM이었습니다.그런 다음 단백질 용액을 0.22μm PVDF 필터에 통과시킨 후 신속하게 냉동하고 -80°C에서 보관했습니다.단백질 K18은 Alberto Boffi 교수가 친절하게 제공했습니다.SDS-PAGE 및 MALDI-TOF/TOF로 확인된 바와 같이 제제의 순도는 >95%였습니다.다양한 시스테인은 AlexaFluor488-말레이미드(AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) 또는 TEMPOL-말레이미드(Toronto Research Chemicals, 토론토, 캐나다)로 화학적으로 표지되었습니다.흡광도와 MALDI-TOF/TOF로 확인하였다.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau 및 K18은 동일한 절차에 따라 Atto647N-말레이미드(ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany)를 사용하여 위치 191 및 322에서 천연 시스테인 잔기로 표지되었습니다.αS 및 Tau441에 대한 잔류물당 순 전하 맵은 CIDER66을 사용하여 생성되었습니다.
고체 폴리-L-리신(미국 앨라배마주 헌츠빌 소재 공급업체 Alamanda Polymers Inc의 NMR에 따른 pLK DP 90-110)을 10mM HEPES, 100mM NaCl, pH 7.4 내지 10mM 농도에 용해시키고 5분간 초음파 처리했습니다. 초음파 수조에 몇 분 동안 담근 후 -20°C에 보관하세요.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) 및 FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA)은 수용성이며 LLPS 완충액에 널리 분포되어 있습니다.투석은 오염된 염분을 제거합니다.그런 다음 0.22 μm의 기공 크기를 갖는 주사기 필터를 통해 여과하고 굴절계(Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA)를 사용하여 농도를 계산했습니다.LLPS 샘플은 실온에서 다음 순서로 준비되었습니다. 완충액과 압출액을 혼합하고 1mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1mM 2,2,2,2-(에탄- 1,2-디일디니트릴) 테트라아세트산(EDTA, 카르복신트) 및 1% 프로테아제 억제제(PMSF 100mM, 벤즈이미드 1mM, 류펩틴 5μM)의 혼합물.그런 다음 αS 및 융합된 다중양이온(옵션 pLK 또는 Tau)이 추가됩니다.티오플라빈-T 시계열 실험(ThT, Carbosynth, Compton, UK)의 경우 총 ThT 농도를 사용하여 αS 농도의 절반이 되도록 합니다.샘플을 부드럽지만 철저하게 혼합하여 균일한지 확인합니다.결과 섹션에 설명된 대로 각 구성 요소의 농도는 실험마다 다양했습니다.실험 기간이 4시간을 초과할 때마다 아지드를 0.02%(w/v) 농도로 사용했습니다.LLPS 샘플을 사용하는 모든 분석의 경우 분석 전 혼합물이 5분 동안 평형을 이루도록 하십시오.광산란 분석을 위해 150μl의 샘플을 비결합 96웰 마이크로플레이트(μClear®, 검정색, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria)에 로드하고 접착 필름으로 덮었습니다.CLARIOstar 플레이트 판독기(BMG Labtech, Ortenberg, Germany)에서 용액 중앙의 350 nm에서 흡광도를 측정하여 LLP를 모니터링했습니다.실험은 25°C에서 3회 수행되었으며 오차는 평균으로부터의 표준편차로 계산되었습니다.희석상은 샘플 원심분리와 SDS-PAGE 겔 분석을 통해 정량화되었으며, 희석상과 농축상의 αS 분획은 다양한 LLPS 용액에서 정량화되었습니다.1μM AF488-표지된 αS를 함유하는 100μl LLPS 샘플은 철저한 혼합 후 9600xg에서 30분 동안 원심분리하여 제조되었으며, 그 후 침전물은 일반적으로 보입니다.상청액의 상위 50 μl를 SDS-PAGE 젤을 사용한 단백질 정량에 사용했습니다.ChemiDoc 겔 이미징 시스템(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 AF488 필터로 겔을 스캔하거나 Coomassie 염색으로 염색하고 적절한 필터로 시각화했습니다.결과 밴드는 ImageJ 버전 1.53i(미국 국립보건원)를 사용하여 분석되었습니다.실험은 유사한 결과를 갖는 두 가지 다른 실험으로 이중으로 수행되었습니다.
일반적으로 150μl의 샘플을 비결합 96웰 마이크로플레이트에 적용하고 실온에서 Leica DMI6000B 도립 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 시각화했습니다.스팟 실험을 위해 μ-슬라이드 혈관신생 플레이트(Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) 또는 96웰 폴리스티렌 마이크로플레이트(Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts)도 사용되었습니다.EL6000 할로겐 또는 수은 메탈 할라이드 램프가 조명 광원으로 사용되었습니다(각각 BF/DIC 및 WF 이미징용).WF 현미경의 경우 40x 배율 공기 대물렌즈(Leica Microsystems, Germany)를 사용하여 샘플에 빛을 집중시키고 수집했습니다.AF488 및 ThT 라벨이 붙은 샘플의 경우 표준 GFP 필터 세트, 여기 및 방출 대역 통과 필터, 각각 460-500 nm 및 512-542 nm 대역 통과 필터 및 495 nm 이색성 거울을 사용하여 여기 및 방출을 필터링합니다.Atto647N으로 라벨이 붙은 샘플의 경우 여기 및 방출 대역 통과 필터가 각각 628-40nm 및 692-40nm인 Cy5 필터 표준 세트와 660nm 이색성 거울이 사용되었습니다.BF 및 DIC 현미경의 경우 동일한 반사광 수집 대물렌즈를 사용합니다.수집된 빛은 Leica DFC7000 CCD 카메라(Leica Microsystems, Germany)에 기록되었습니다.노출 시간은 BF 및 DIC 현미경 이미징의 경우 50ms이고 WF 현미경 이미징의 경우 20-100ms였습니다.비교를 위해 ThT를 사용한 모든 실험의 노출 시간은 100ms였습니다.액적 유착을 시각화하기 위해 저속 실험을 수행했으며, 이미지는 몇 분 동안 100ms마다 수집되었습니다.이미지 분석에는 ImageJ(NIH, USA)를 사용했습니다.실험은 유사한 결과로 3회 수행되었습니다.
공동 국소화 실험, FRAP 및 3D 재구성을 위해 ZEN 2 블루 에디션(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)을 사용하여 Zeiss LSM 880 역 공초점 현미경에서 이미지를 획득했습니다.50μl 샘플을 µ-Slide Angiogenic Petri 접시(Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germany)에 적용하고 친수성 폴리머(ibiTreat)로 처리한 후 63× 오일 침지 대물렌즈(Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil)에 장착했습니다. DIC에서).이미지는 470~600nm, 493~628nm의 여기 및 방출 감지 창에 대해 0.26μm/픽셀의 해상도와 8μs/픽셀의 노출 시간을 갖춘 458nm, 488nm 및 633nm 아르곤 레이저 라인을 사용하여 획득했습니다. 638-755nm는 각각 ThT, AF488 및 Atto647N을 시각화하는 데 사용되었습니다.FRAP 실험의 경우 각 샘플의 저속 촬영 사진이 초당 1프레임으로 기록되었습니다.실험은 실온에서 3회 반복 수행되었으며 유사한 결과가 나타났습니다.모든 이미지는 Zen 2 블루 에디션 소프트웨어(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)를 사용하여 분석되었습니다.FRAP 곡선은 OriginPro 9.1을 사용하여 Zen 2를 사용하여 이미지에서 추출한 강도/시간 데이터에 정규화, 플롯 및 피팅되었습니다.회복 곡선은 획득 표백 효과를 설명하기 위해 추가 지수 항을 사용하여 분자 확산을 설명하기 위해 단일 지수 모델에 맞춰졌습니다.그런 다음 Kang 등의 방정식에서와 같이 공칭 표백 반경과 이전에 결정된 회복 반감기를 사용하여 D를 계산했습니다.5 35 표시됨.
αS의 단일 시스테인 변이체는 24번(TEMPOL-24-αS) 및 122번(TEMPOL-122-αS) 위치에 4-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-N-옥실(TEMPOL)이 합성되었으며, 각기.스핀 라벨링 EPR 실험의 경우 αS 농도는 100μM로 설정되었고 PEG 농도는 15%(w/v)였습니다.다양한 응집 조건에서 αS:pLK 비율은 1:10이었고 αS:ΔNt-Tau 및 αS:Tau441 비율은 1:1로 유지되었습니다.크라우딩이 없는 결합 적정 실험을 위해 TEMPOL-122-αS를 50 μM로 유지하고 폴리양이온을 증가하는 농도로 적정하여 각 조건을 별도로 준비했습니다.CW-EPR 측정은 ~9.7GHz의 마이크로파(SHF) 주파수에서 작동하는 Bruker ER4118 SPT-N1 공진기가 장착된 Bruker ELEXSYS E580 X-밴드 분광계를 사용하여 수행되었습니다.온도는 25°C로 설정되었으며 액체 질소 저온 유지 장치로 제어되었습니다.스펙트럼은 MW 전력 4mW, 변조 진폭 0.1mT, 변조 주파수 100kHz의 불포화 조건에서 얻어졌습니다.Tau441 또는 ΔNt-Tau(원래 단백질 용액에 존재)를 포함하는 샘플에서 환원제의 잔류 농도로 인한 샘플 간 스핀 농도의 차이와 가능한 스핀 감소를 피하기 위해 스펙트럼 강도를 정규화했습니다.주어진 g 값은 Matlab®67에 구현된 Easyspin 소프트웨어(v. 6.0.0-dev.34)를 사용하여 수행한 EPR 스펙트럼 모델링의 결과로 얻은 것입니다.1/2개 구성요소 등방성 모델을 사용하여 데이터를 모델링했습니다.모든 신호를 정규화한 후 해당 실험 스펙트럼에서 각 시뮬레이션을 빼서 잔차를 계산했습니다.결합 적정 분석을 위해 정규화된 EPR 스펙트럼(IIII/III)의 두 번째 밴드에 대한 세 번째 밴드의 상대 강도를 사용하여 αS에 대한 폴리양이온의 결합을 모니터링했습니다.해리 상수(Kd)를 추정하기 위해 결과 곡선은 n개의 동일하고 독립적인 결합 사이트를 가정하는 대략적인 모델에 맞춰졌습니다.
NMR 분광학 실험은 냉동탐침과 Z-구배가 장착된 Bruker Neo 800MHz(1H) NMR 분광계를 사용하여 수행되었습니다.모든 실험은 10mM HEPES, 100mM NaCl, 10% DO, pH 7.4에서 130-207μM αS 및 해당 αS/ΔNt-Tau 및 pLK 등가물을 사용하여 수행되었으며 15°C에서 수행되었습니다.NMR로 LPS를 모니터링하기 위해 미리 혼합된 샘플에 10% PEG를 첨가했습니다.화학적 이동 섭동 플롯(그림 1b)은 평균 1H 및 15N 화학적 이동을 보여줍니다.αS 2D1H-15N HSQC 스펙트럼은 이전 할당(BMRB 항목 #25227)을 기반으로 할당되었으며 HNCA, HNCO 및 CBCAcoNH의 3D 스펙트럼을 기록하고 분석하여 확인되었습니다.13Cα 및 13Cβ 화학적 이동은 순수 랜덤 코일 형태 68(보충 그림 5c)의 αS 화학적 이동과 비교하여 2차 구조 추세의 가능한 변화를 측정하기 위해 ΔNt-Tau 또는 pLK가 있는 경우 계산되었습니다.R1ρ 속도는 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 및 800ms의 지연으로 hsqctretf3gpsi 실험(Bruker 라이브러리에서 얻은)을 기록하여 측정되었으며 지수 함수는 서로 다른 피크 강도 지연에 맞게 조정되었습니다. R1ρ와 실험적 불확실성을 결정하는 데 시간이 걸립니다.
2색 시간 분해 형광 현미경 실험은 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC) 장치를 사용하여 상업용 시간 분해 MT200 형광 공초점 현미경(PicoQuant, Berlin, Germany)에서 수행되었습니다.레이저 다이오드 헤드는 PIE(펄스 인터리브 여기)에 사용되며, 빔은 단일 모드 도파관을 통과하고 이색성 거울 이후에 측정된 481nm 및 637nm 레이저 라인에 대해 10~100nW의 레이저 출력으로 조정됩니다.이는 광자 앨리어싱, 광표백 및 포화의 영향을 피하면서 최적의 광자 계수 속도를 보장합니다.μ-Slide 혈관 신생 커버슬립 또는 플레이트(Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany)를 교정 칼라가 있는 Super Apochromat 60x NA 1.2 렌즈(Olympus Life Sciences, Waltham, USA) 위에 침지수에 직접 넣었습니다.488/640 nm 이색성 거울(Semrock, Lake Forest, IL, USA)을 메인 빔 스플리터로 사용했습니다.초점이 맞지 않은 방사선은 직경 50미크론의 구멍으로 차단된 다음, 초점이 맞춰진 방사선은 50/50 빔 스플리터에 의해 2개의 감지 경로로 나뉩니다.녹색 염료(AF488)의 경우 밴드패스 방출 필터(Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35와 빨간색 염료(Atto647N)의 경우 690/70을 검출기 앞에 사용했습니다.단일 광자 눈사태 다이오드(SPAD)(Micro Photon Devices, Bolzano, Italy)가 검출기로 사용되었습니다.데이터 수집과 분석은 모두 시중에서 판매되는 SymphoTime64 소프트웨어(PicoQuant GmbH, Berlin, Germany)를 사용하여 수행되었습니다.
50 마이크로리터의 LLPS 샘플을 μ-Slide 혈관신생 웰(Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany)에 적용했습니다.결과 이미지는 부유 액적에 대한 최적의 객관적인 작동 거리를 위해 웰 바닥 위 20μm에 초점을 맞추고 최소 0.25μm/픽셀의 축 해상도와 400μs/픽셀의 지연 시간을 갖춘 래프트 및 도트의 경우 ~1μm에 초점을 맞춥니다.액체 단백질 방울, 뗏목 또는 반점만 선택되도록 각 채널의 평균 배경 신호 강도(PBG, 평균 + 2σ)를 기반으로 강도 임계값을 적용하여 분산된 단계에서 가능한 모든 원점을 필터링하여 데이터를 선택합니다.각 채널(AF488의 경우 녹색, "g", Atto647N의 경우 빨간색, "r")의 각 종(τ)의 수명을 분석하기 위해 물방울, 뗏목 또는 반점을 포함하는 관심 영역(ROI)을 선택했습니다(보충 그림 1). ).8b) 테일 핏 분석과 2 성분 붕괴 모델을 사용하여 각 채널에 수명 붕괴 (각각 물방울, 뗏목 또는 반점에 대한 τD, τR 및 τP, 보충 그림 8c 참조)를 피팅하여 파생되었습니다.τ에서 평균 τ.다중 지수 적합을 위해 너무 적은 광자를 생성한 ROI는 분석에서 제외되었습니다.사용된 컷오프는 뗏목 및 도트의 경우 <104 광자, 낙하의 경우 103입니다.이미지 필드의 액적은 일반적으로 더 작고 수가 적기 때문에 더 높은 강도 값으로 붕괴 곡선을 얻는 것이 어렵기 때문에 액적의 임계값이 더 낮습니다.광자 축적 한계(>500개/픽셀로 설정)를 초과하는 광자 개수를 갖는 ROI도 분석을 위해 삭제되었습니다.모든 강도 감쇠에 대해 동일하게 유지하면서 IRF 간섭을 최소화하기 위해 서비스 수명 시작부터 관심 영역에서 얻은 강도 감쇠 곡선을 최대치의 90% 강도(감쇠의 최대 강도 약간 뒤)와 일치시킵니다. 설정 상대 시간 창 뗏목 및 지점에 대해 25~50 ROI, 낙하에 대해 15~25 ROI를 분석했으며, 이미지는 최소 3번의 독립적인 실험에서 기록된 4회 이상의 반복 복제에서 선택되었습니다.종간 또는 코아세르베이트 시스템 간의 통계적 차이를 평가하기 위해 양측 t-검정이 사용되었습니다.수명(τ)의 픽셀별 분석을 위해 각 채널에 대한 필드에 대한 수명의 총 감쇠를 계산하고 2/3 성분 지수 감쇠 모델의 근사치를 수행했습니다.그런 다음 이전에 계산된 τ 값을 사용하여 각 픽셀의 수명 감쇠를 피팅하여 의사 색상 FLIM 맞춤 이미지를 얻었습니다.테일 핏 수명 범위는 동일한 채널의 모든 이미지에서 동일했으며 각 붕괴는 안정적인 핏을 제공하기에 충분한 광자를 생성했습니다.FRET 분석을 위해 픽셀은 100광자의 더 낮은 강도 임계값을 적용하여 선택되었으며, 이는 평균 11광자의 배경 신호(FBG)입니다.각 채널의 형광 강도는 실험적으로 결정된 보정 계수에 의해 보정되었습니다. 69 스펙트럼 누화 α는 0.004, 직접 여기 β는 0.0305, 검출 효율 γ는 0.517이었습니다.그런 다음 픽셀 수준의 FRET 효율성은 다음 방정식을 사용하여 계산됩니다.
여기서 FDD는 공여자(녹색) 채널에서 관찰된 형광 강도이고, FDA는 간접 여기 하에서 억셉터(빨간색) 채널에서 관찰된 형광 강도이며, FAA는 직접 여기 하에서 억셉터(빨간색) 채널에서 관찰된 형광 강도입니다( 파이).채널에서 형광 강도 펄스가 관찰됩니다.
LLPS 완충액(위와 같이 보충됨)에 25μM의 표지되지 않은 단량체 Tau441(25μM αS가 포함되거나 포함되지 않음)을 포함하는 LLPS 반응 용액 100μl를 접착 호일 코팅이 포함된 비결합 96웰 마이크로플레이트에 놓고 액적 형성을 WF 현미경으로 확인했습니다. 평형.10분 이내.실온에서 48시간 배양 후 단백질 뗏목과 반점의 존재를 확인하였다.그런 다음 우물에서 뗏목 위에 있는 액체를 조심스럽게 제거한 다음 50L의 해리 완충액(10mM HEPES, pH 7.4, 1M NaCl, 1mM DTT)을 추가하고 10분 동안 배양합니다.염 농도가 높으면 잔류 PEG로 인해 LLPS가 반복되지 않으며 정전기 상호 작용에 의해서만 형성된 가능한 단백질 어셈블리가 분해됩니다.그런 다음 웰의 바닥을 마이크로피펫 팁으로 조심스럽게 긁어내고 생성된 용액을 빈 관찰 웰로 옮겼습니다.샘플을 50 μM ThT와 함께 1시간 동안 배양한 후 분리된 반점의 존재를 WF 현미경으로 확인했습니다.7일 동안 궤도 셰이커에서 pH 7.4, 아지드화 나트륨 0.01%, 37°C 및 200rpm으로 PBS에 70μM αS 용액 300μl를 배양하여 초음파 처리된 αS 원섬유를 준비합니다.그런 다음 용액을 9600 xg에서 30분 동안 원심분리하고, 펠릿을 PBS pH 7.4에 재현탁하고 초음파 처리했습니다(Vibra-Cell VC130 초음파 처리기에서 1분, 50% 주기, 80% 진폭, Sonics, Newton, USA). 작은 원섬유의 상대적으로 균일한 크기 분포를 가지고 있습니다.
FCS/FCCS 분석 및 2색 일치 검출(TCCD)은 PIE 모드를 사용하여 FLIM-FRET 현미경 실험에 사용된 것과 동일한 MT200 시간 분해 형광 공초점 현미경(Pico-Quant, Berlin, Germany)에서 수행되었습니다.이러한 실험을 위한 레이저 출력은 6.0μW(481nm) 및 6.2μW(637nm)에 추가되었습니다.최적의 카운트 속도를 달성하고 광표백 및 포화를 방지하면서 사용된 형광단 쌍에 대해 유사한 밝기를 생성하기 위해 이러한 레이저 출력의 조합이 선택되었습니다.데이터 수집 및 분석은 모두 시중에서 판매되는 SymphoTime64 버전 2.3 소프트웨어(PicoQuant, Berlin, Germany)를 사용하여 수행되었습니다.
LLPS를 사용하여 얻은 분리된 αS/Tau 응집체의 샘플은 분리 완충액에서 적절한 단분자 농도로 희석됩니다(코아세르베이트 시료에서 분리할 때 응집체가 이미 낮은 농도이기 때문에 일반적으로 1:500 희석).샘플을 1mg/mL 농도의 BSA 용액으로 사전 코팅된 커버슬립(Corning, USA)에 직접 적용했습니다.
녹색 및 빨간색 채널의 PIE-smFRET 분석의 경우 단량체 이벤트로 인한 저강도 신호를 필터링하기 위해 25개 광자의 더 낮은 강도 임계값이 적용되었습니다(단량체는 격리된 집계에 비해 집계된 샘플보다 많음).이 임계값은 분석용 응집체를 구체적으로 선택하기 위해 순수 단량체 샘플 분석에서 얻은 단량체 αS의 평균 강도의 5배로 계산되었습니다.PIE 구동 회로는 TSCPC 데이터 수집과 함께 배경 및 스펙트럼 혼선을 제거하는 데 도움이 되는 수명 가중치 필터의 적용을 가능하게 했습니다.위의 임계값을 사용하여 선택된 플레어 강도는 버퍼 전용 샘플의 발생 대 강도/bin의 히스토그램에서 결정된 평균 배경 신호를 사용하여 수정되었습니다.대규모 집계와 관련된 버스트는 일반적으로 시간 추적(1ms로 설정)에서 여러 개의 연속된 빈을 차지합니다.이 경우 최대 강도의 용기가 선택되었습니다.FRET 및 화학양론적 분석을 위해 이론적으로 결정된 감마 인자 γ(0.517)를 사용했습니다.사용된 여기 레이저 전력에서는 스펙트럼 누화 및 직접 여기 기여도가 무시할 수 있습니다(실험적으로 결정됨).폭발 시 FRET의 효율과 화학양론은 다음과 같이 계산됩니다.