304 스테인레스 스틸 코일 튜빙 화학 성분, SPACA6 엑토도메인의 구조에는 배우자 융합과 관련된 보존된 단백질 수퍼패밀리가 포함되어 있습니다.

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SPACA6은 정자에서 발현되는 표면 단백질로, 포유류의 성적 생식 과정에서 배우자 융합에 중요한 역할을 합니다.이러한 근본적인 역할에도 불구하고 SPACA6의 구체적인 기능은 잘 알려져 있지 않습니다.우리는 SPACA6의 세포외 도메인의 결정 구조를 2.2 Å의 해상도로 밝히고, 준유연한 링커로 연결된 4가닥 다발과 Ig 유사 β-샌드위치로 구성된 2도메인 단백질을 나타냅니다.이 구조는 또 다른 배우자 융합 관련 단백질인 IZUMO1과 유사하여 SPACA6 및 IZUMO1이 본원에서 IST 슈퍼패밀리라고 불리는 수정 관련 단백질 슈퍼패밀리의 창립 구성원이 되도록 합니다.IST 수퍼패밀리는 꼬인 4개의 나선 다발과 한 쌍의 이황화물 연결 CXXC 모티프로 구조적으로 정의됩니다.인간 프로테옴에 대한 구조 기반 AlphaFold 검색을 통해 이 슈퍼패밀리의 추가 단백질 구성원이 확인되었습니다.특히, 이들 단백질 중 다수는 배우자 융합에 관여합니다.SPACA6 구조와 IST 슈퍼패밀리의 다른 구성원과의 관계는 포유류 배우자 융합에 대한 우리의 지식에서 누락된 연결고리를 제공합니다.
모든 인간의 삶은 두 개의 분리된 반수체 배우자, 즉 아버지의 정자와 어머니의 난자에서 시작됩니다.이 정자는 수백만 개의 정자 세포가 여성 생식기를 통과하고, 다양한 장애물을 극복하고, 운동성과 표면 구성 요소의 과정을 향상시키는 능력 강화를 겪는 강렬한 선택 과정의 승자입니다2,3,4.정자와 난모세포가 서로를 찾아낸다고 해도 그 과정은 아직 끝난 것이 아닙니다.난모세포는 난구 세포층과 투명대라고 불리는 당단백질 장벽으로 둘러싸여 있으며, 정자는 이를 통과하여 난모세포로 들어가야 합니다.정자는 표면 접착 분자와 막 관련 및 분비 효소의 조합을 사용하여 이러한 최종 장벽을 극복합니다5.이러한 분자와 효소는 주로 내막과 첨체기질에 저장되어 있으며 첨체반응 중에 정자의 외막이 용해될 때 검출됩니다6.이 강렬한 여정의 마지막 단계는 두 세포가 막을 융합하여 단일 이배체 유기체가 되는 정자-난자 융합 사건입니다7.이 과정은 인간 생식에 있어서 획기적인 것이지만, 필요한 분자 상호작용은 제대로 이해되지 않고 있습니다.
배우자의 수정 외에도 두 지질 이중층의 융합 화학이 광범위하게 연구되었습니다.일반적으로 막 융합은 단백질 촉매가 두 개의 막을 서로 더 가깝게 만들어 연속성을 깨뜨리고 융합을 일으키는 구조적 형태 변화를 겪도록 하는 에너지적으로 불리한 과정입니다8,9.이러한 단백질 촉매는 융합물질(fusogen)로 알려져 있으며 수많은 융합 시스템에서 발견되었습니다.이는 바이러스가 숙주 세포로 진입하는 데 필요합니다(예: HIV-1의 gp160, 코로나바이러스의 스파이크, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌)10,11,12 태반(신시틴)13,14,15 및 하등 진핵생물의 배우자 형성 융합( 식물, 원생생물 및 절지동물의 HAP2/GCS1) 16,17,18,19.여러 단백질이 배우자 부착 및 융합에 중요한 것으로 나타났지만 인간 배우자에 대한 융합원은 아직 발견되지 않았습니다.마우스와 인간 배우자의 융합에 필요한 막횡단 단백질인 난모세포에서 발현된 CD9가 처음으로 발견되었습니다21,22,23.정확한 기능은 아직 불분명하지만 접착의 역할, 난자 미세융모의 접착 초점 구조 및/또는 난모세포 표면 단백질의 올바른 위치 지정이 가능성이 있는 것으로 보입니다 24,25,26.배우자 융합에 중요한 두 가지 가장 일반적인 단백질은 정자 단백질 IZUMO127과 난모세포 단백질 JUNO28이며, 이들의 상호 연관성은 융합 전 배우자 인식 및 접착에 있어 중요한 단계입니다.수컷 Izumo1 녹아웃 마우스와 암컷 Juno 녹아웃 마우스는 완전히 불임 상태이며, 이 모델에서 정자는 난황주위 공간으로 들어가지만 생식세포는 융합되지 않습니다.유사하게, 인간 체외 수정 실험에서 배우자를 항-IZUMO1 또는 JUNO 항체로 처리할 때 합류가 감소했습니다.
최근 IZUMO1 및 JUNO20,30,31,32,33,34,35와 표현형적으로 유사한 정자 발현 단백질 그룹이 새로 발견되었습니다.정자 첨체막 관련 단백질 6(SPACA6)은 대규모 쥐 돌연변이 유발 연구에서 수정에 필수적인 것으로 확인되었습니다.Spaca6 유전자에 이식유전자를 삽입하면 융합되지 않는 정자가 생성되지만, 이러한 정자는 난황주위 공간에 침투합니다 36.마우스를 대상으로 한 후속 녹아웃 연구에서는 Spaca6이 배우자 융합에 필요하다는 사실이 확인되었습니다30,32.SPACA6은 고환에서 거의 독점적으로 발현되며 IZUMO1과 유사한 국소화 패턴, 즉 첨체체 반응 전 정자의 내막 내에서 첨체체 반응 후에 적도 영역으로 이동합니다30,32.Spaca6 동족체는 다양한 포유동물 및 기타 진핵생물에 존재하며30 인간 배우자 융합에 대한 이의 중요성은 SPACA6에 대한 저항성에 의한 시험관 내 인간 수정 억제로 입증되었습니다30.IZUMO1 및 JUNO와 달리 SPACA6의 구조, 상호 작용 및 기능에 대한 세부 사항은 아직 명확하지 않습니다.
인간의 정자와 난자의 융합에 깔려 있는 기본 과정을 더 잘 이해하고 이를 통해 가족 계획 및 불임 치료의 미래 발전에 정보를 제공하기 위해 SPACA6 구조 및 생화학적 연구를 수행했습니다.SPACA6의 세포외 도메인의 결정 구조는 4나선 다발(4HB)과 준유연 영역으로 연결된 면역글로불린 유사(Ig 유사) 도메인을 보여줍니다.이전 연구에서 예측한 바와 같이, SPACA6의 도메인 구조는 인간 IZUMO1의 도메인 구조와 유사하며, 두 단백질은 특이한 모티프, 즉 삼각형 나선형 표면을 가진 4HB와 한 쌍의 이황화물 연결 CXXC 모티프를 공유합니다.우리는 IZUMO1과 SPACA6이 이제 배우자 융합과 관련된 더 크고 구조적으로 관련된 단백질 슈퍼패밀리를 정의한다고 제안합니다.슈퍼패밀리 고유의 특징을 사용하여 우리는 AlphaFold 구조적 인간 프로테옴에 대한 철저한 검색을 수행하여 배우자 융합 및/또는 수정과 관련된 여러 구성원을 포함하여 이 슈퍼패밀리의 추가 구성원을 식별했습니다.이제 배우자 융합과 관련된 단백질의 일반적인 구조적 접힘과 슈퍼패밀리가 있는 것으로 보이며, 우리의 구조는 인간 배우자 융합 메커니즘의 중요한 측면에 대한 분자 지도를 제공합니다.
SPACA6은 1개의 N-연결 글리칸과 6개의 추정 이황화 결합을 갖는 단일 통과 막횡단 단백질입니다(그림 S1a 및 S2).우리는 Drosophila S2 세포에서 인간 SPACA6(잔기 27-246)의 세포외 도메인을 발현하고 니켈 친화성, 양이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제했습니다(그림 S1b).정제된 SPACA6 엑토도메인은 매우 안정적이고 균질합니다.다각형 광산란(SEC-MALS)과 결합된 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 분석에서는 계산된 분자량이 26.2 ± 0.5 kDa인 피크 하나가 나타났습니다(그림 S1c).이는 SPACA6 단량체 엑토도메인의 크기와 일치하며, 이는 정제 중에 올리고머화가 발생하지 않았음을 나타냅니다.또한 원형 이색성(CD) 분광법은 융점이 51.3°C인 혼합 α/β 구조를 나타냈습니다(그림 S1d,e).CD 스펙트럼의 Deconvolution은 38.6%의 α-나선형 요소와 15.8%의 β-가닥 요소를 나타냈습니다(그림 S1d).
SPACA6 엑토도메인은 랜덤 매트릭스 시딩38을 사용하여 결정화되어 2.2Å의 해상도를 갖는 데이터 세트를 생성했습니다(표 1 및 그림 S3).구조 결정을 위한 브롬화물 노출과 함께 조각 기반 분자 치환과 SAD 위상 조정 데이터의 조합을 사용하여(표 1 및 그림 S4) 최종 정제된 모델은 잔기 27-246으로 구성됩니다.구조가 결정된 당시에는 실험적이거나 AlphaFold 구조를 사용할 수 없었습니다.SPACA6 엑토도메인은 20 Å × 20 Å × 85 Å 크기로 7개의 나선과 9개의 β 가닥으로 구성되며 6개의 이황화 결합으로 안정화된 길쭉한 3차 접힘을 가지고 있습니다(그림 1a, b).Asn243 측쇄 말단의 약한 전자 밀도는 이 잔기가 N-연결 글리코실화임을 나타냅니다.구조는 N 말단 4 나선 다발 (4HB)과 중간 힌지 영역이있는 C 말단 Ig 유사 도메인의 두 도메인으로 구성됩니다 (그림 1c).
SPACA6의 세포외 도메인 구조.SPACA6의 세포외 도메인의 스트립 다이어그램은 N에서 C 말단까지의 사슬 색상이 진한 파란색에서 진한 빨간색까지입니다.이황화 결합과 관련된 시스테인은 자홍색으로 강조 표시됩니다.b SPACA6의 세포외 도메인 토폴로지.그림 1a와 동일한 색 구성표를 사용합니다.c SPACA6 세포외 도메인.4HB, 힌지, Ig형 도메인 스트립 차트는 각각 주황색, 녹색, 파란색으로 표시됩니다.레이어는 일정한 비율로 그려지지 않습니다.
SPACA6의 4HB 도메인에는 나선형 나선 형태로 배열된 4개의 주요 나선(나선 1-4)이 포함되어 있으며(그림 2a), 역평행 상호작용과 평행 상호작용이 번갈아 나타납니다(그림 2b).작은 추가 단일 회전 나선(나선 1')이 다발에 수직으로 배치되어 나선 1과 2가 있는 삼각형을 형성합니다. 이 삼각형은 나선 3과 4의 상대적으로 조밀한 패킹의 나선형 꼬임 패킹에서 약간 변형됩니다( 그림 2a).
4HB N 단자 스트립 차트.b 네 개의 나선 묶음의 평면도. 각 나선은 N 말단에서 진한 파란색으로 강조 표시되고 C 말단에서는 진한 빨간색으로 강조 표시됩니다.c 4HB에 대한 하향식 나선형 휠 다이어그램. 각 잔기는 단일 문자 아미노산 코드로 표시된 원으로 표시됩니다.바퀴 상단에 있는 4개의 아미노산에만 번호가 매겨져 있습니다.비극성 잔기는 노란색, 극성 비전하 잔기는 녹색, 양전하를 띤 잔기는 파란색, 음전하를 띤 잔기는 빨간색으로 표시됩니다.d 4HB 도메인의 삼각형 면, 4HB는 주황색이고 경첩은 녹색입니다.두 그림 모두 막대 모양의 이황화 결합을 보여줍니다.
4HB는 주로 지방족 및 방향족 잔기로 구성된 내부 소수성 코어에 집중되어 있습니다(그림 2c).코어에는 나선형 1과 2를 상부 삼각형으로 연결하는 Cys41과 Cys55 사이의 이황화 결합이 포함되어 있습니다 (그림 2d).Helix 1'의 CXXC 모티프와 힌지 영역의 β-머리핀 끝에서 발견된 또 다른 CXXC 모티프 사이에 두 개의 추가 이황화 결합이 형성되었습니다(그림 2d).기능이 알려지지 않은 보존적 아르기닌 잔기(Arg37)는 나선 1', 1 및 2로 형성된 속이 빈 삼각형 내부에 위치합니다. 지방족 탄소 원자 Cβ, Cγ 및 Cδ Arg37은 소수성 코어와 상호 작용하고 그 구아니딘 그룹이 주기적으로 이동합니다. Thr32 백본과 측쇄 사이의 상호 작용을 통해 나선 1 '과 1 사이 (그림 S5a, b).Tyr34는 Arg37이 용매와 상호 작용할 수 있는 두 개의 작은 공동을 남기고 공동으로 확장됩니다.
Ig 유사 β-샌드위치 도메인은 소수성 코어를 통해 상호 작용하는 두 개 이상의 다중 가닥 양친매성 β-시트의 공통 특징을 공유하는 대규모 단백질 수퍼패밀리입니다. SPACA6의 C-말단 Ig 유사 도메인은 동일한 패턴을 갖습니다. 두 개의 레이어로 구성됩니다 (그림 S6a).시트 1은 4개의 가닥(가닥 D, F, H, I)으로 구성된 β-시트로, 가닥 F, H, I는 역평행 배열을 형성하고 가닥 I과 D는 평행 상호작용을 합니다.표 2는 작은 역평행 이중 가닥 베타 시트(가닥 E 및 G)입니다.E 사슬의 C-말단과 H 사슬의 중심(Cys170-Cys226) 사이에 내부 이황화 결합이 관찰되었습니다(그림 S6b).이 이황화 결합은 면역글로불린의 β-샌드위치 도메인의 이황화 결합과 유사합니다40,41.
4가닥의 β 시트는 전체 길이를 따라 비틀어져 모양과 정전기 특성이 다른 비대칭 모서리를 형성합니다.더 얇은 가장자리는 SPACA6의 나머지 고르지 않고 정전기적으로 다양한 표면과 비교하여 눈에 띄는 평평한 소수성 환경 표면입니다(그림 S6b,c).노출된 백본 카르보닐/아미노 그룹과 극성 측쇄의 후광이 소수성 표면을 둘러싸고 있습니다(그림 S6c).더 넓은 마진은 소수성 코어의 N 말단 부분을 차단하고 F 사슬 백본의 개방형 극성 그룹과 3개의 수소 결합을 형성하는 캡핑된 나선형 세그먼트로 덮여 있습니다(그림 S6d).이 가장자리의 C 말단 부분은 부분적으로 노출된 소수성 코어가 있는 큰 포켓을 형성합니다.포켓은 3세트의 이중 아르기닌 잔기(Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 및 Arg212-Arg214)와 중앙 히스티딘(His220)으로 인해 양전하로 둘러싸여 있습니다(그림 S6e).
힌지 영역은 나선형 도메인과 Ig 유사 도메인 사이의 짧은 세그먼트로, 하나의 역평행 3가닥 β층(가닥 A, B 및 C), 작은 310 나선 및 여러 개의 긴 무작위 나선형 세그먼트로 구성됩니다.(그림 S7).힌지 영역의 공유 및 정전기 접촉 네트워크는 4HB와 Ig 유사 도메인 사이의 방향을 안정화시키는 것으로 보입니다.네트워크는 세 부분으로 나눌 수 있습니다.첫 번째 부분은 힌지의 β-헤어핀과 4HB의 1' 나선 사이에 한 쌍의 이황화 결합을 형성하는 두 개의 CXXC 모티프(27CXXC30 및 139CXXC142)를 포함합니다.두 번째 부분에는 Ig 유사 도메인과 힌지 사이의 정전기적 상호 작용이 포함됩니다.힌지의 Glu132는 Ig 유사 도메인의 Arg233 및 힌지의 Arg135와 염다리를 형성합니다.세 번째 부분은 Ig 유사 도메인과 힌지 영역 사이의 공유 결합을 포함합니다.두 개의 이황화 결합(Cys124-Cys147 및 Cys128-Cys153)은 힌지 루프를 Gln131과 백본 작용기 사이의 정전기적 상호작용에 의해 안정화되는 링커에 연결하여 첫 번째 Ig 유사 도메인에 대한 접근을 허용합니다.체인.
SPACA6 엑토도메인의 구조와 4HB 및 Ig 유사 도메인의 개별 구조를 사용하여 단백질 데이터베이스에서 구조적으로 유사한 기록을 검색했습니다42.우리는 높은 Dali Z 점수, 작은 표준 편차 및 큰 LALI 점수(후자는 구조적으로 동일한 잔기의 수)와 일치하는 항목을 식별했습니다.전체 엑토도메인 검색(표 S1)의 처음 10개 히트는 허용 가능한 Z-점수가 >842인 반면, 4HB 또는 Ig 유사 도메인에 대한 검색만으로는 이러한 히트의 대부분이 β-샌드위치에만 해당하는 것으로 나타났습니다.많은 단백질에서 발견되는 편재적인 접힘.Dali의 세 가지 검색 모두 IZUMO1이라는 하나의 결과만 반환했습니다.
SPACA6과 IZUMO1은 구조적 유사성을 공유한다는 것이 오랫동안 제안되어 왔습니다7,32,37.이 두 배우자 융합 관련 단백질의 엑토도메인은 단지 21%의 서열 동일성을 공유하지만(그림 S8a), 보존된 이황화 결합 패턴과 SPACA6의 예측된 C 말단 Ig 유사 도메인을 포함한 복잡한 증거를 통해 IZUMO1을 템플릿으로 사용하는 SPACA6 마우스 A의 상동성 모델.우리의 구조는 이러한 예측을 확인하고 실제 유사도를 보여줍니다.실제로 SPACA6 및 IZUMO137,43,44 구조는 힌지 영역으로 연결된 유사한 4HB 및 Ig 유사 β-샌드위치 도메인과 동일한 2-도메인 아키텍처(그림 S8b)를 공유합니다(그림 S8c).
IZUMO1 및 SPACA6 4HB는 기존 나선형 번들과 공통된 차이점을 가지고 있습니다.엔도솜 융합에 관여하는 SNARE 단백질 복합체에서 발견되는 것과 같은 전형적인 4HB는 중심축 주위에 일정한 곡률을 유지하는 균일한 간격의 나선을 가지고 있습니다 47. 대조적으로, IZUMO1과 SPACA6 둘 다의 나선 도메인은 가변적인 곡률과 고르지 않은 포장(그림 S8d).나선 1', 1, 2에 의해 형성된 삼각형으로 인해 발생한 비틀림은 IZUMO1과 SPACA6에 유지되고 나선 1'의 동일한 CXXC 모티프에 의해 안정화됩니다.그러나 SPACA6(위의 나선형 1과 2를 공유적으로 연결하는 Cys41 및 Cys55)에서 발견된 추가 이황화 결합은 삼각형 꼭지점에서 더 날카로운 꼭지점을 생성하여 SPACA6을 IZUMO1보다 더 비틀어지게 만들고 더 뚜렷한 공동 삼각형을 갖게 합니다.또한 IZUMO1에는 SPACA6의 이 공동 중앙에서 관찰되는 Arg37이 없습니다.대조적으로, IZUMO1은 지방족 및 방향족 잔기의 보다 전형적인 소수성 코어를 가지고 있습니다.
IZUMO1은 이중 가닥과 5가닥의 β-시트로 구성된 Ig 유사 도메인을 가지고 있습니다.IZUMO1의 추가 가닥은 F 가닥과 상호 작용하여 가닥의 백본 수소 결합을 제한하는 SPACA6의 코일을 대체합니다.흥미로운 비교 점은 두 단백질의 Ig 유사 도메인의 예상 표면 전하입니다.IZUMO1 표면은 SPACA6 표면보다 더 음전하를 띠고 있습니다.추가 전하는 정자막을 향한 C-말단 근처에 위치합니다.SPACA6에서는 동일한 영역이 더 중성이거나 양전하를 띠었습니다 (그림 S8e).예를 들어, SPACA6의 소수성 표면(더 얇은 가장자리)과 양으로 하전된 구덩이(더 넓은 가장자리)는 IZUMO1에서 음으로 하전됩니다.
IZUMO1과 SPACA6 사이의 관계와 2차 구조 요소는 잘 보존되어 있지만 Ig 유사 도메인의 구조적 정렬은 두 도메인이 서로에 대한 일반적인 방향이 다르다는 것을 보여주었습니다(그림 S9).IZUMO1의 나선형 다발은 β-샌드위치 주위로 구부러져 있으며, 중심 축에서 약 50° 위치에 앞서 설명한 "부메랑" 모양을 만듭니다.대조적으로, SPACA6의 나선형 빔은 반대 방향으로 약 10° 기울어졌습니다.이러한 방향의 차이는 힌지 영역의 차이로 인해 발생할 수 있습니다.1차 서열 수준에서 IZUMO1과 SPACA6은 시스테인, 글리신 및 아스파르트산 잔기를 제외하고 힌지에서 서열 유사성이 거의 없습니다.결과적으로 수소 결합과 정전기 네트워크는 완전히 다릅니다.β-시트 2차 구조 요소는 IZUMO1과 SPACA6에 의해 공유되지만, IZUMO1의 사슬은 훨씬 길고 310 나선(나선 5)은 SPACA6에 고유합니다.이러한 차이로 인해 두 개의 유사한 단백질에 대해 서로 다른 도메인 방향이 발생합니다.
우리의 Dali 서버 검색에 따르면 SPACA6과 IZUMO1은 이 특정 4HB 접힘을 갖는 단백질 데이터베이스에 저장된 실험적으로 결정된 유일한 두 개의 구조입니다(표 S1).최근에는 DeepMind(Alphabet/Google)가 1차 서열로부터 단백질의 3D 구조를 정확하게 예측할 수 있는 신경망 기반 시스템인 AlphaFold를 개발했습니다48.SPACA6 구조를 해결한 직후 AlphaFold 데이터베이스가 출시되어 인간 프로테옴48,49의 모든 단백질의 98.5%를 포괄하는 예측 구조 모델을 제공했습니다.해결된 SPACA6 구조를 검색 모델로 사용하여 AlphaFold 인간 프로테옴의 모델에 대한 구조적 상동성 검색을 통해 SPACA6 및 IZUMO1과 구조적으로 유사할 수 있는 후보를 식별했습니다.SPACA6(그림 S10a), 특히 해결된 구조(그림 S10b)와 비교하여 1.1Å rms 엑토도메인을 예측하는 데 있어 AlphaFold의 놀라운 정확도를 고려하면 식별된 SPACA6 일치가 정확할 가능성이 있다고 확신할 수 있습니다.
이전에 PSI-BLAST는 세 가지 다른 정자 관련 단백질인 IZUMO2, IZUMO3 및 IZUMO450을 사용하여 IZUMO1 클러스터를 검색했습니다.AlphaFold는 이러한 IZUMO 계열 단백질이 Ig 유사 도메인이 부족함에도 불구하고 IZUMO1(그림 3a 및 S11)과 동일한 이황화 결합 패턴을 사용하여 4HB 도메인으로 접힌다고 예측했습니다.IZUMO2와 IZUMO3는 IZUMO1과 유사한 일면성 막 단백질인 반면, IZUMO4는 분비되는 것으로 가정됩니다.배우자 융합에서 IZUMO 2, 3, 4 단백질의 기능은 아직 밝혀지지 않았습니다.IZUMO3는 정자 발달 동안 첨체 생합성에 역할을 하는 것으로 알려져 있으며51 IZUMO 단백질은 복합체를 형성하는 것으로 밝혀졌습니다50.포유류, 파충류 및 양서류에서 IZUMO 단백질의 보존은 이들의 잠재적인 기능이 DCST1/2, SOF1 및 FIMP와 같은 다른 알려진 배우자 융합 관련 단백질의 기능과 일치함을 시사합니다.
4HB, 힌지 및 Ig 유사 도메인이 각각 주황색, 녹색 및 파란색으로 강조 표시된 IST 슈퍼패밀리의 도메인 아키텍처 다이어그램.IZUMO4에는 검은색으로 보이는 독특한 C 말단 영역이 있습니다.확인된 이황화 결합과 추정되는 이황화 결합은 각각 실선과 점선으로 표시됩니다.b IZUMO1(PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2(AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3(AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4(AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) 및 TMEM95(AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1)은 패널 A와 동일한 색상 범위로 표시됩니다. 이황화 결합은 자홍색으로 표시됩니다.TMEM95, IZUMO2 및 IZUMO3 막횡단 나선은 표시되지 않습니다.
IZUMO 단백질과 달리 다른 SPACA 단백질(예: SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 및 SPACA9)은 SPACA6과 구조적으로 다른 것으로 생각됩니다(그림 S12).SPACA9만이 4HB를 가지고 있지만 SPACA6과 동일한 평행-역평행 배향이나 동일한 이황화 결합을 가질 것으로 예상되지는 않습니다.SPACA1만이 유사한 Ig 유사 도메인을 가지고 있습니다.AlphaFold는 SPACA3, SPACA4 및 SPACA5가 SPACA6과 완전히 다른 구조를 가질 것으로 예측합니다.흥미롭게도 SPACA4는 수정에 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 SPACA6보다 훨씬 더 광범위하게 정자와 난모세포 투명대 사이의 상호 작용을 촉진합니다52.
AlphaFold 검색에서 IZUMO1 및 SPACA6 4HB, TMEM95와 일치하는 또 다른 항목을 찾았습니다.단일 정자 특이적 막횡단 단백질인 TMEM95는 절제 시 수컷 마우스를 불임으로 만듭니다 32,33.TMEM95가 결여된 정자는 정상적인 형태, 운동성 및 투명대를 관통하여 난막에 결합하는 능력을 가졌으나 난모세포 막과 융합할 수는 없었습니다.이전 연구에서는 TMEM95가 IZUMO133과 구조적 유사성을 공유하는 것으로 나타났습니다.실제로 AlphaFold 모델은 TMEM95가 IZUMO1 및 SPACA6과 동일한 CXXC 모티프 쌍과 SPACA6에서 발견된 나선 1과 2 사이의 동일한 추가 이황화 결합을 가진 4HB임을 확인했습니다(그림 3a 및 S11).TMEM95에는 Ig 유사 도메인이 없지만 SPACA6 및 IZUMO1 힌지 영역과 유사한 이황화 결합 패턴을 갖는 영역이 있습니다(그림 3b).이 원고가 출판될 당시 사전 인쇄 서버는 TMEM95의 구조를 보고하여 AlphaFold53 결과를 확인했습니다.TMEM95는 SPACA6 및 IZUMO1과 매우 유사하며 이미 양서류에서 진화적으로 보존되어 있습니다(그림 4 및 S13).
PSI-BLAST 검색에서는 NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP 및 SOF1 데이터베이스를 사용하여 생명 나무에서 이러한 서열의 위치를 ​​결정했습니다.분기점 사이의 거리는 축척에 따라 표시되지 않습니다.
SPACA6과 IZUMO1 사이의 놀라운 전반적인 구조적 유사성은 이들이 TMEM95 및 IZUMO 2, 3 및 4 단백질을 포함하는 보존된 구조적 슈퍼패밀리의 창립 구성원임을 시사합니다.알려진 멤버: IZUMO1, SPACA6 및 TMEM95.소수의 구성원만이 Ig 유사 도메인을 보유하기 때문에 IST 수퍼패밀리의 특징은 4HB 도메인이며, 이는 모든 단백질에 공통된 고유한 특징을 가지고 있습니다. 1) 나선이 역평행/평행 교대로 배열된 코일형 4HB(그림 . 5a), 2) 다발은 다발 내의 두 개의 나선과 세 번째 수직 나선으로 구성된 삼각형 면을 가지고 있습니다(그림 핵심 영역(그림 5c). 티오레독신 유사 단백질에서 발견되는 CXXC 모티프가 기능하는 것으로 알려져 있습니다. 산화환원 센서로서 54,55,56, IST 계열 구성원의 모티프는 배우자 융합에서 ERp57과 같은 단백질 이황화물 이성화효소와 연관될 수 있습니다. 역할은 연관되어 있습니다57,58.
IST 슈퍼패밀리의 구성원은 4HB 도메인의 세 가지 특징, 즉 평행 방향과 역평행 방향을 번갈아 사용하는 4개의 나선, 바삼각형 나선형 다발 면, 작은 분자 사이에 형성된 ca CXXC 이중 모티프로 정의됩니다.) N 말단 나선(주황색) 및 힌지 영역 β-머리핀(녹색).
SPACA6과 IZUMO1 사이의 유사성을 고려하여 전자가 IZUMO1 또는 JUNO에 결합하는 능력을 테스트했습니다.BLI(생물층 간섭계)는 이전에 IZUMO1과 JUNO 사이의 상호 작용을 정량화하는 데 사용되었던 운동 기반 결합 방법입니다.고농도의 JUNO 분석물을 미끼로 IZUMO1과 함께 비오틴 표지 센서를 배양한 후 강한 신호가 감지되었으며(그림 S14a), 이는 센서 팁에 부착된 생체 물질의 두께에 대한 결합 유도 변화를 나타냅니다.유사한 신호(즉, IZUMO1 분석물에 대한 미끼로 센서에 결합된 JUNO)(그림 S14b).SPACA6이 센서 결합 IZUMO1 또는 센서 결합 JUNO에 대한 분석물로 사용되었을 때 신호가 감지되지 않았습니다(그림 S14a,b).이 신호가 없다는 것은 SPACA6의 세포외 도메인이 IZUMO1 또는 JUNO의 세포외 도메인과 상호작용하지 않는다는 것을 나타냅니다.
BLI 분석은 미끼 단백질의 유리 라이신 잔기의 바이오티닐화를 기반으로 하기 때문에 라이신 잔기가 상호작용에 관여하는 경우 이 변형은 결합을 방지할 수 있습니다.또한, 센서에 대한 결합 방향은 입체 장애를 생성할 수 있으므로 재조합 SPACA6, IZUMO1 및 JUNO 엑토도메인에 대해 기존 풀다운 분석도 수행되었습니다.그럼에도 불구하고 SPACA6은 His 태그가 붙은 IZUMO1 또는 His 태그가 붙은 JUNO와 함께 침전되지 않았으며(그림 S14c,d) 이는 BLI 실험에서 관찰된 것과 일치하는 상호 작용이 없음을 나타냅니다.양성 대조군으로서 JUNO와 His IZUMO1이라는 라벨이 붙은 상호 작용을 확인했습니다(그림 S14e 및 S15).
SPACA6과 IZUMO1의 구조적 유사성에도 불구하고 SPACA6이 JUNO를 결합할 수 없다는 것은 놀라운 일이 아닙니다.인간 IZUMO1의 표면에는 세 영역 각각의 잔기를 포함하여 JUNO와 상호작용하는 20개 이상의 잔기가 있습니다(대부분 힌지 영역에 위치함)(그림 S14f).이러한 잔기 중 SPACA6(Glu70)에는 하나만 보존됩니다.많은 잔기 치환이 원래의 생화학적 특성을 유지하는 반면, IZUMO1의 필수 Arg160 잔기는 SPACA6의 음전하를 띤 Asp148로 대체되었습니다.이전 연구에서는 IZUMO1의 Arg160Glu 돌연변이가 JUNO43에 대한 결합을 거의 완전히 없애는 것으로 나타났습니다.또한, IZUMO1과 SPACA6 사이의 도메인 방향의 차이는 SPACA6의 등가 영역의 JUNO 결합 부위의 표면적을 크게 증가시켰습니다(그림 S14g).
배우자 융합을 위한 SPACA6의 필요성과 IZUMO1과의 유사성에도 불구하고 SPACA6은 동등한 JUNO 바인딩 기능을 갖고 있지 않은 것으로 보입니다.따라서 우리는 구조적 데이터를 진화 생물학이 제공하는 중요성의 증거와 결합하려고 노력해 왔습니다.SPACA6 상동체의 서열 정렬은 포유동물을 넘어서는 공통 구조의 보존을 보여줍니다.예를 들어 시스테인 잔류물은 먼 친척의 양서류에도 존재합니다(그림 6a).ConSurf 서버를 사용하여 66개 서열의 다중 서열 정렬 보존 데이터가 SPACA6 표면에 매핑되었습니다.이러한 유형의 분석은 단백질 진화 중에 어떤 잔기가 보존되었는지 보여줄 수 있으며 어떤 표면 영역이 기능에 중요한 역할을 하는지 나타낼 수 있습니다.
CLUSTAL OMEGA를 사용하여 제조된 12개 종의 SPACA6 엑토도메인의 서열 정렬.ConSurf 분석에 따르면 가장 보수적인 입장은 파란색으로 표시됩니다.시스테인 잔기는 빨간색으로 강조 표시됩니다.도메인 경계와 2차 구조 요소는 정렬 상단에 표시되며, 여기서 화살표는 β-가닥을 나타내고 파도는 나선을 나타냅니다.시퀀스를 포함하는 NCBI 액세스 식별자는 인간(Homo sapiens, NP_001303901), 맨드릴(Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), 꼬리감기 원숭이(Cebus 모방, XP_017359366), 말(Equus caballus, XP_023506102), 범고래(Orcinus orca3_23 XP_)입니다. 032_034) .), 양(Ovis aries, XP_014955560), 코끼리(Loxodonta africana, XP_010585293), 개(Canis lupus familyis, XP_025277208), 쥐(Mus musculus, NP_001156381), 태즈메이니아 데빌(Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), 오리너구리, 8) , 61_89 및 Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).번호 매기기는 인간의 순서에 따라 이루어집니다.b 상단에 4HB가 있고 하단에 Ig와 유사한 도메인이 있는 SPACA6 구조의 표면 표현, 색상은 ConSurf 서버의 보존 추정치를 기반으로 합니다.가장 잘 보존된 부분은 파란색, 적당히 보존된 부분은 흰색, 가장 덜 보존된 부분은 노란색입니다.보라색 시스테인.높은 수준의 보호를 보여주는 3개의 표면 패치가 패치 1, 2, 3으로 표시된 삽입에 표시됩니다. 4HB 만화는 오른쪽 상단의 삽입에 표시됩니다(동일한 색상 구성).
SPACA6 구조는 세 개의 고도로 보존된 표면 영역을 가지고 있습니다(그림 6b).패치 1은 4HB와 힌지 영역에 걸쳐 있으며 2개의 보존된 CXXC 이황화물 다리, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 힌지 네트워크(그림 S7) 및 3개의 보존된 외부 방향족 잔기(Phe31, Tyr73, Phe137)를 포함합니다.정자 표면의 여러 양전하를 띤 잔기를 나타내는 Ig 유사 도메인의 더 넓은 테두리 (그림 S6e).흥미롭게도, 이 패치에는 SPACA6 30 기능을 방해하는 것으로 이전에 밝혀진 항체 에피토프가 포함되어 있습니다.영역 3은 Ig 유사 도메인의 힌지와 한쪽에 걸쳐 있습니다.이 영역에는 보존된 프롤린(Pro126, Pro127, Pro150, Pro154)과 바깥쪽을 향한 극성/전하 잔기가 포함되어 있습니다.놀랍게도 4HB 표면의 대부분의 잔기는 매우 가변적이지만 (그림 6b) 접힘은 SPACA6 동족체 전체 (소수성 번들 코어의 보존성에 의해 표시됨)와 IST 수퍼 패밀리를 넘어 보존됩니다.
이는 감지 가능한 2차 구조 요소가 가장 적은 SPACA6에서 가장 작은 영역이지만 많은 힌지 영역 잔재(영역 3 포함)가 SPACA6 동족체 사이에서 고도로 보존되어 있으며 이는 나선형 다발과 β-샌드위치의 방향이 중요한 역할을 한다는 것을 나타낼 수 있습니다.보수주의자로서.그러나 SPACA6 및 IZUMO1의 힌지 영역의 광범위한 수소 결합 및 정전기 네트워크에도 불구하고 IZUMO137,43,44의 다중 허용 구조 정렬에서 고유한 유연성의 증거를 볼 수 있습니다.개별 도메인의 정렬은 잘 겹쳐졌지만 서로에 대한 도메인의 방향은 중심 축에서 50°에서 70°까지 다양했습니다(그림 S16).용액에서 SPACA6의 구조 역학을 이해하기 위해 SAXS 실험이 수행되었습니다 (그림 S17a, b).SPACA6 엑토도메인의 Ab initio 재구성은 막대 결정 구조를 따르지만(그림 S18), Kratky 플롯은 어느 정도 유연성을 보여주었습니다(그림 S17b).이 형태는 결합되지 않은 단백질이 격자와 용액 모두에서 부메랑 모양을 취하는 IZUMO1과 대조됩니다.
유연한 영역을 구체적으로 식별하기 위해 SPACA6에서 수소-중수소 교환 질량 분석법(H-DXMS)을 수행하고 이전에 IZUMO143에서 얻은 데이터와 비교했습니다(그림 7a,b).SPACA6은 100,000초 교환 후 구조 전반에 걸쳐 더 높은 중수소 교환으로 입증되는 것처럼 IZUMO1보다 확실히 더 유연합니다.두 구조 모두에서 힌지 영역의 C 말단 부분은 높은 수준의 교환을 나타내며, 이는 아마도 서로에 대해 4HB 및 Ig 유사 도메인의 제한된 회전을 허용합니다.흥미롭게도 147CDLPLDCP154 잔기로 구성된 SPACA6 힌지의 C 말단 부분은 고도로 보존된 영역 3(그림 6b)으로, 도메인 간 유연성이 SPACA6의 진화적으로 보존된 특징임을 나타낼 수 있습니다.유연성 분석에 따르면, CD 열 용융 데이터는 SPACA6(Tm = 51.2°C)이 IZUMO1(Tm = 62.9°C)보다 안정성이 떨어지는 것으로 나타났습니다(그림 S1e 및 S19).
SPACA6 및 b IZUMO1의 H-DXMS 이미지.표시된 시점에서 중수소 교환 비율을 결정했습니다.수소-중수소 교환 수준은 파란색(10%)에서 빨간색(90%)까지의 그라데이션 눈금으로 색상으로 표시됩니다.블랙박스는 교류가 많은 영역을 나타냅니다.결정 구조에서 관찰되는 4HB, 힌지 및 Ig 유사 도메인의 경계는 기본 시퀀스 위에 표시됩니다.10초, 1000초 및 100,000초의 중수소 교환 수준은 SPACA6 및 IZUMO1의 투명한 분자 표면에 겹쳐진 스트립 차트에 표시되었습니다.중수소 교환 수준이 50% 미만인 구조의 일부는 흰색으로 표시됩니다.50% H-DXMS 교환을 초과하는 영역은 그라데이션 눈금으로 색상이 지정됩니다.
CRISPR/Cas9 및 마우스 유전자 녹아웃 유전 전략을 사용하면 정자와 난자의 결합 및 융합에 중요한 여러 요인이 확인되었습니다.IZUMO1-JUNO와 CD9 구조의 잘 알려진 상호 작용 외에도 배우자 융합과 관련된 대부분의 단백질은 구조적으로나 기능적으로 수수께끼로 남아 있습니다.SPACA6의 생물물리학적 및 구조적 특성은 수정 중 접착/융합 분자 퍼즐의 또 다른 부분입니다.
SPACA6 및 IST 슈퍼패밀리의 다른 구성원은 포유류뿐만 아니라 개별 조류, 파충류 및 양서류에서도 고도로 보존된 것으로 보입니다.실제로 SPACA6은 제브라피시 59의 수정에도 필요하다고 생각됩니다. 이 분포는 DCST134, DCST234, FIMP31 및 SOF132와 같은 다른 알려진 배우자 융합 관련 단백질과 유사하며, 이는 이러한 요인이 HAP2가 결핍되어 있음을 시사합니다. 많은 원생생물의 촉매 활성을 담당하는 단백질인 GCS1)로 알려져 있습니다., 식물 및 절지동물.수정된 융합 단백질 60, 61. SPACA6과 IZUMO1 사이의 강한 구조적 유사성에도 불구하고, 이들 단백질 중 하나를 코딩하는 유전자의 녹아웃은 수컷 생쥐에서 불임을 초래했으며, 이는 배우자 융합에서의 기능이 복제되지 않음을 나타냅니다..보다 광범위하게, 융합의 접착 단계에 필요한 알려진 정자 단백질 중 어느 것도 중복되지 않습니다.
SPACA6(및 IST 수퍼패밀리의 다른 구성원)이 게임간 접합에 참여하는지, 게임 내 네트워크를 형성하여 중요한 단백질을 융합 지점으로 모집하는지, 아니면 파악하기 어려운 융합원으로 작용하는지 여부는 아직 공개된 질문으로 남아 있습니다.HEK293T 세포의 공동 면역침전 연구는 전장 IZUMO1과 SPACA632 사이의 상호 작용을 밝혀냈습니다.그러나 우리의 재조합 엑토도메인은 시험관 내에서 상호작용하지 않았으며, 이는 Noda et al.둘 다 구조물에서 삭제되었습니다(수정에 불필요한 것으로 밝혀진 IZUMO1의 세포질 꼬리에 주목하십시오62).대안으로, IZUMO1 및/또는 SPACA6은 생리학적으로 특정한 형태 또는 다른 단백질(알려졌거나 아직 발견되지 않은)을 포함하는 분자 복합체와 같이 시험관 내에서 재현할 수 없는 특정 결합 환경을 요구할 수 있습니다.IZUMO1 엑토도메인은 난황 주위 공간에서 난자에 정자의 부착을 중재하는 것으로 여겨지지만 SPACA6 엑토도메인의 목적은 불분명합니다.
SPACA6의 구조는 단백질-단백질 상호작용에 관여할 수 있는 몇 가지 보존된 표면을 드러냅니다.CXXC 모티프(위의 패치 1로 지정됨)에 바로 인접한 힌지 영역의 보존된 부분에는 종종 생체분자 간의 소수성 및 π-스태킹 상호작용과 관련된 여러 개의 외부 방향 방향족 잔기가 있습니다.Ig 유사 도메인(영역 2)의 넓은 측면은 고도로 보존된 Arg 및 His 잔기가 있는 양전하 홈을 형성하며, 이 영역에 대한 항체는 이전에 배우자 융합을 차단하는 데 사용되었습니다 30 .항체는 6개의 아르기닌 잔기 중 3개와 고도로 보존된 His220을 갖는 선형 에피토프 212RIRPAQLTHRGTFS225를 인식합니다.기능 장애가 이러한 특정 잔기의 막힘으로 인한 것인지 아니면 전체 영역의 막힘으로 인한 것인지는 확실하지 않습니다.β-샌드위치의 C-말단 근처에 있는 이 간격의 위치는 이웃 정자 단백질과의 시스-상호작용을 나타내지만 난모세포 단백질과는 그렇지 않음을 나타냅니다.더욱이, 힌지 내 유연성이 뛰어난 프롤린이 풍부한 엉킴(사이트 3)이 유지되는 것은 단백질-단백질 상호작용이 일어나는 부위일 수도 있고, 두 도메인 사이의 유연성이 유지된다는 것을 의미할 가능성이 더 높습니다.SPACA6의 알려지지 않은 역할에는 성별이 중요합니다.배우자의 융합.
SPACA6은 Ig 유사 β-샌드위치를 ​​포함한 세포간 접착 단백질의 특성을 가지고 있습니다.많은 접착 단백질(예: 카드헤린, 인테그린, 접착인 및 IZUMO1)은 세포막에서 환경 표적까지 단백질을 확장하는 하나 이상의 β-샌드위치 도메인을 보유합니다.SPACA6의 Ig 유사 도메인에는 접착 및 응집의 β-샌드위치에서 흔히 발견되는 모티프가 포함되어 있습니다. 즉, 기계적 클램프로 알려진 β-샌드위치의 끝 부분에 있는 평행 가닥의 이중선입니다.이 모티프는 전단력에 대한 저항성을 증가시키는 것으로 여겨지며, 이는 세포간 상호작용에 관여하는 단백질에 유용합니다.그러나 이러한 어드헤신과의 유사성에도 불구하고 SPACA6가 달걀 흰자와 상호 작용한다는 증거는 현재 없습니다.SPACA6 엑토도메인은 JUNO에 결합할 수 없으며 여기에 표시된 SPACA6 발현 HEK293T 세포는 구역이 결여된 난모세포와 거의 상호 작용하지 않습니다.SPACA6가 게임간 결합을 설정하는 경우 이러한 상호 작용은 번역 후 수정이 필요하거나 다른 정자 단백질에 의해 안정화될 수 있습니다.후자의 가설을 뒷받침하는 것으로, IZUMO1이 결핍된 정자는 난모세포에 결합하며, 이는 IZUMO1 이외의 분자가 생식세포 접착 단계에 관여한다는 것을 입증합니다(27).
많은 바이러스, 세포 및 발생 융합 단백질은 융합원으로서의 기능을 예측하는 특성을 가지고 있습니다.예를 들어, 바이러스 융합 당단백질(클래스 I, II 및 III)은 숙주 막에 삽입되는 단백질 끝에 소수성 융합 펩타이드 또는 루프를 가지고 있습니다.IZUMO143의 친수성 지도와 IST 슈퍼패밀리의 구조(결정 및 예측)에서는 뚜렷한 소수성 융합 펩타이드가 나타나지 않았습니다.따라서 IST 수퍼패밀리의 단백질이 융합원으로 기능하는 경우 다른 알려진 예와는 다른 방식으로 기능합니다.
결론적으로, 배우자 융합과 관련된 IST 슈퍼패밀리 단백질 구성원의 기능은 여전히 ​​감질나는 미스터리로 남아 있습니다.우리의 특성화된 SPACA6 재조합 분자와 그 분해된 구조는 이러한 공유 구조 사이의 관계와 배우자 부착 및 융합에서의 역할에 대한 통찰력을 제공할 것입니다.
예측된 인간 SPACA6 엑토도메인(NCBI 수탁 번호 NP_001303901.1, 잔기 27-246)에 해당하는 DNA 서열을 Drosophila melanogaster S2 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화하고 Kozak(Eurofins Genomics)을 코딩하는 서열을 갖는 유전자 단편으로 합성했습니다., BiP 분비 신호 및 상응하는 5' 및 3' 말단은 퓨로마이신(pMT-puro)으로 선택하기 위해 변형된 메탈로티오네인 프로모터를 기반으로 하는 pMT 발현 벡터로의 이 유전자의 결찰 독립적 클로닝을 위한 것입니다.pMT-puro 벡터는 트롬빈 절단 부위와 그 뒤에 10x-His C-말단 태그를 인코딩합니다(그림 S2).
SPACA6 pMT-puro 벡터를 D. melanogaster S2(Gibco) 세포로 안정적으로 형질감염시키는 것은 IZUMO1 및 JUNO43에 사용된 프로토콜과 유사하게 수행되었습니다.S2 세포를 해동하고 최종 농도 10%(v/v) 열 불활성화 송아지 태아 혈청(Gibco) 및 1X 항진균 항생제(Gibco)가 보충된 Schneider 배지(Gibco)에서 성장시켰습니다.초기 계대 세포(3.0 x 106개 세포)를 6웰 플레이트(Corning)의 개별 웰에 플레이팅했습니다.27℃에서 24시간 배양한 후, 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 SPACA6 pMT-puro 벡터 2mg과 Effectene 형질감염 시약(Qiagen)의 혼합물로 형질감염시켰다.형질감염된 세포를 72시간 동안 배양한 후 6 mg/ml 퓨로마이신과 함께 수확했습니다.그런 다음 세포를 완전한 Schneider's 배지에서 분리하고 대규모 단백질 생산을 위해 무혈청 Insect-XPRESS 배지(Lonza)에 넣었습니다.S2 세포 배양의 1L 배치를 2L 환기형 바닥이 편평한 폴리프로필렌 삼각 플라스크에서 8~10 x 106ml-1 세포로 성장시킨 후 최종 농도 500μM CuSO4(Millipore Sigma)로 멸균하고 멸균 여과했습니다.유도.유도된 배양물을 27℃, 120rpm에서 4일 동안 배양하였다.
SPACA6을 함유하는 조건화된 배지는 4℃에서 5660 xg로 원심분리한 후 10 kDa MWCO 막을 갖춘 Centramate 접선 유동 여과 시스템(Pall Corp)을 사용하여 분리했습니다.SPACA6을 함유한 농축 배지를 2ml Ni-NTA 아가로스 수지(Qiagen) 컬럼에 적용합니다.Ni-NTA 수지를 10 컬럼 부피(CV)의 완충액 A로 세척한 후 1CV의 완충액 A를 첨가하여 50mM의 최종 이미다졸 농도를 제공했습니다.SPACA6은 최종 농도가 500 mM이 되도록 이미다졸이 보충된 10 ml의 완충액 A로 용출되었습니다.제한 등급 트롬빈(Millipore Sigma)을 투석용 1L 10mM Tris-HCl, pH 7.5 및 150mM NaCl(완충액 B)과 비교하여 SPACA6 mg당 1단위로 투석 튜브(MWCO 12-14kDa)에 직접 추가했습니다.) 4°C에서 48시간 동안.이어서, 트롬빈-절단된 SPACA6을 3배 희석하여 염 농도를 감소시키고, 10mM Tris-HCl, pH 7.5로 평형화된 1ml MonoS 5/50 GL 양이온 교환 컬럼(Cytiva/GE)에 로딩했습니다.양이온 교환기를 3 CV의 10mM Tris-HCl, pH 7.5로 세척한 후, SPACA6을 25CV에 대해 10mM Tris-HCl, pH 7.5 중 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰습니다.이온 교환 크로마토그래피 후 SPACA6을 1ml로 농축하고 완충액 B로 평형화된 ENrich SEC650 10 x 300 컬럼(BioRad)에서 등용매적으로 용출했습니다. 크로마토그램에 따르면 SPACA6을 포함하는 풀 및 농축 분획입니다.순도는 16% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 쿠마시 염색 전기영동에 의해 조절되었습니다.단백질 농도는 Beer-Lambert 법칙과 이론적 몰흡광계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도로 정량화되었습니다.
정제된 SPACA6을 10mM 인산나트륨, pH 7.4 및 150mM NaF에 대해 밤새 투석하고 CD 분광학으로 분석하기 전에 0.16mg/mL로 희석했습니다.185 ~ 260nm 파장의 CD 스펙트럼 스캐닝은 25°C에서 50nm/분의 속도로 1mm 광학 경로 길이(Helma)의 석영 큐벳을 사용하여 Jasco J-1500 분광편광계에서 수집되었습니다.CD 스펙트럼은 기준선을 수정하고 10회 획득에 대한 평균을 낸 후 cm2/dmol 단위의 평균 잔류 타원율(θMRE)로 변환했습니다.
여기서 MW는 각 샘플의 분자량(Da)입니다.N은 아미노산의 수이며;θ는 밀리도 단위의 타원율입니다.d는 cm 단위의 광 경로 길이에 해당합니다.단백질 농도(단위).